文献(4): Nature子刊_晚期非小细胞肺癌的单细胞图谱

今天介绍的这一篇文献[Ref1],发表在NC上,中规中矩,分析内容很全面也很常见(话说,NC上面好多这种描述性的单细胞文章)。

下面我会简单介绍一下文献内容,涉及到以下内容,大家可能会感兴趣:

  1. 这篇文章是如何鉴定肿瘤细胞的?(我之前专门写过一篇推文讲这个)
  2. 肿瘤细胞和非肿瘤细胞一起降维聚类时,需不需要去批次?
  3. 肿瘤细胞的异质性可以从哪几个角度说明?
  4. 肿瘤细胞的拟时序/轨迹分析怎么做?
  5. monocle2的经典图怎么看?
  6. 细胞通讯分析怎么做?有哪些经典的受配体对?

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1. 背景

我们从标题中大概能知道这篇文献的主要工作是集中在晚期NSCLC的肿瘤异质性、肿瘤微环境。去年的统计数据显示肺癌已经是我国发生率和死亡率最高的癌症。
大家做单细胞的原因很多时候都是为了解决异质性的问题,为什么用药之后有的人有效而有的人没效,为什么刚开始有效过段时间又没效,这其中根本的原因就在于异质性,肿瘤细胞本身有异质性,周围的微环境也有异质性。最终的愿景是希望在完全了解透这些异质性后,能给患者分组,每一组给予特定的治疗方案。

2. 实验设计和初步结果

这张图显示了这篇研究的样本组成,有肺腺癌 肺鳞癌,有三期 四期,他们是否吸烟,有无致癌突变。这个图的展示形式还挺清晰的。

左上图展示了鉴定出来的11种主要的细胞类型,需要注意的是,这里面把CancerEpithelialAlveolar是区分开的,也就是说肿瘤取样也可能含有正常的上皮细胞。这篇文章里面鉴定肿瘤细胞,方法非常简单,首先得是上皮细胞(高表达EPCAM),然后不表达肺部组织正常上皮细胞的marker。比我之前讲的方法简单多了,准确性如何呢,我持保留意见,不过下文的CNV热图我们可以看到有一些病人所有肿瘤细胞是几乎没有CNV的。
左下图是病人来源信息,从图中可以看出,这张图是没有去批次效应的。原因有两个:一是对于非肿瘤细胞的亚群,不同病人聚类比较好,二是在这张图中,不想抹掉肿瘤细胞的肿瘤间异质性。这是原文的解释,我也很赞同,所以当你遇到肿瘤细胞、非肿瘤细胞一起聚类的情况,可以不去批次。非肿瘤细胞单独拿出来聚类就另说了。
右边两张图就比较常规了,marker基因热图(之前总结过展示marker基因的几种图,第一篇、第二篇),细胞亚群占比。

3. 解析肿瘤异质性
3.1 肿瘤间异质性

a图是根据腺癌、鳞癌,有无突变分组后,比较CNV(前面写过三篇inferCNV相关的帖子,学完可以画出更好看的CNV热图)。作者发现肺腺癌在chromosome 7 and 8q有扩增,在chromosome 10有缺失;肺鳞癌在3q有扩增,在5q有缺失。该结论并不是在所有病人中都成立。
b图c图一起看,C图是说这些肿瘤细胞可以聚成20类,b图说的是每一个病人中,每个cluster的占比。从b图可以看出在多数的肺腺癌中(图的右边1/3的样本)会聚到一起(很像),并且每个病人中只有一个主要的cluster;而肺鳞癌病人之间没有那么像,并且好几个病人有多个cluster。这说明肺鳞癌有更高的肿瘤间异质性,以及更高的克隆性。
这一部分是肿瘤间异质性:腺癌鳞癌之间,病人之间。

3.2 肿瘤内异质性

为了定量肿瘤内部的异质性(ITH),作者定义了两个ITH分数,一个基于表达矩阵得到ITH_GEX,一个基于inferCNV输出的矩阵得到ITH_CNA。在矩阵中,所有细胞两两之间算一个相关系数,对于这些数值的分布,0.75分位数减去0.25分位数就得到这个分数。左图显示这两个ITH分数有一定的相关性,但不强,因为CNV虽然可以影响基因表达,但基因表达还受很多其他因素的调控,比如TF、小RNA、点突变、与周围环境的细胞互作等等。
右图比较了不同分组之间的ITH分数。

4. 正常上皮细胞到肿瘤细胞的轨迹分析

关于肿瘤细胞的拟时序,我见过正常上皮细胞和肿瘤细胞放在一块来分析的,几乎没有见过肿瘤细胞单独做拟时序,而且我也觉得这样做没什么道理,我觉得肿瘤细胞不同状态是一种优胜劣汰的关系,不同状态之间是否会相互转变感觉不是很明确(我没说EMT, CSC这种线性的转变),所以即使做了拟时序结果也不一定可靠。

  • 如果正常上皮细胞之间的发育轨迹已经清楚,将其作为参考,和肿瘤细胞一起做轨迹分析,可以知道正常上皮细胞发育的哪些阶段更容易发展成肿瘤细胞(其实这种情况,从表达谱相似性也能看出来,之所以还要这么做,可能是因为大家觉得轨迹分析看上去高大上一些),比如Ref2中的Fig. 2b;
  • 如果正常上皮细胞(多种)向肿瘤细胞进展的关系已经清楚,通过做轨迹分析,可以完善已知路径,明确几种正常上皮细胞是如何发展成肿瘤细胞的,可能是独立的,也可能存在中间状态;也可以同上面一样,看看别的上皮细胞是否也容易发展成肿瘤细胞。

这篇文章是第二种情况,以图中肺鳞癌为例。已知basal cells和club cells可以发展成LUSC肿瘤细胞,做完monocle2发现club cells处在更末端的位置,basal cells处在靠近club cells的枝干上,肿瘤细胞分布在其余位置,因此可以将已知的路径改写成:basal cells似乎是club cells向肿瘤细胞转变的中间状态(原文似乎这个词用得太好了,没把话说绝,也省了实验验证,我学废了)。

5. Th17和Treg潜在的转变

文章说这是首次在肺癌中找到Th17细胞亚群,并揭示了Th17和Treg潜在的转变关系(之前已经被报道过)。
d图是用Slingshot做的,颜色深浅表示拟时序的先后,Th17和Treg之间被连起来,说明存在转换关系。
右边的分支图和热图是monocle2画的,之前刚学monocle2的时候,比较疑惑的是热图里面的fate1和fate2分别表示什么,这张图就说得很清楚了。从你想研究的节点(图中的1节点)到根(一般是人为指定,图中是CD4 naive对应的状态)都是pre-branch,然后沿着拟时序的方向(跟你指定的根状态有关),右边的枝是fate1(对应图中的增殖细胞),左边的枝是fate2(对应Treg细胞)。热图里面选了一些pre-branch、fate1、fate2对应细胞的差异基因来呈现,从热图中间向两边看,能看到不同的fate表达不同的基因。文中说,从图中可以看出Th17是沿着naive到Treg的中间状态。
结合这两种方法,得出Th17和Treg有潜在的转变关系。

6. TME中的免疫细胞组成

在解析了肿瘤细胞、重要免疫细胞之后,作者又看了每个病人中细胞亚群的占比,并探究了哪些因素能影响细胞占比。

file

a图是说,不同的分组影响中性粒细胞的占比,文章是将中性粒细胞作为一种免疫抑制的亚群来说的。
d图是说,随着异质性分数的增加,几种免疫抑制的亚群占比增加,浆细胞亚群占比减少。(浆细胞分泌抗体对肿瘤细胞有一定的杀伤作用,可以通过介导NK细胞,或是激活补体系统等途径,不过抗肿瘤免疫平时说得比较多的还是T细胞杀伤这种细胞免疫方式。)
因此作者得出结论,认为ITH升高,会增加免疫抑制微环境,降低肿瘤杀伤能力。

7. 细胞通讯分析

文章的最后一部分讲的是细胞通讯,虽然作者说不同的分组有不同的细胞间通讯网络,但从文中给的图来看,几组都整体差不多,有个别差异。
如果用过cellphoneDB,会发现输出结果里面有统计学意义的受配体对很多很多,之前比较两组的受配体对,试过肉眼比较两张大热图一个一个看,太花时间了,后来就干脆提前整理好想要比较的受配体对(文章里面经常出现的受配体对就那些),直接从输出文件里面提取,省事很多。
比如,我图中圈出来的几个,

  1. 趋化因子及其受体,说明肿瘤细胞会招募中性粒细胞这种免疫抑制的亚群;
  2. VEGFA相关的受配体,说明肿瘤细胞会促进血管生成(内皮细胞),保证自身营养供应;
  3. Treg表达CTLA4分子,巨噬细胞(作为抗原提呈细胞APC)表达CD86,二者结合,那么能给CD8提供抗原的APC就少了,从而减少CD8的激活;
  4. 耗竭性CD8 T细胞表达CTLA4是一个特征,与APC表达的CD86结合后,启动抑制性信号。
8. 总结

最后总结一下,我觉得的这篇文章的亮点:

  • 填补了晚期非小细胞肺癌单细胞转录组领域的空白
  • 文章第一次在NSCLC中发现了Th17,并揭示了Th17和Treg的潜在转变关系
  • 从多个角度解析了肿瘤的异质性(肿瘤间、肿瘤内都做了分析)
  • ITH与免疫抑制微环境的关系
9. Ref
  1. Single-cell profiling of tumor heterogeneity and the microenvironment in advanced non-small cell lung cancer
  2. Lee, H. O., et al. (2020). "Lineage-dependent gene expression programs influence the immune landscape of colorectal cancer." Nat Genet 52(6): 594-603.

OK啦,这篇文献就说到这里,欢迎三连哈~

因水平有限,有错误的地方,欢迎批评指正!

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