Dynamics and function of DNA methylation in plants

Abstract

DNA甲基化是非常保守的表观修饰，对于基因调控及基因组稳定性十分重要
异常的DNA甲基化模式会导致植物的发育缺陷。一个特定的DNA甲基化状态是由从头甲基化、甲基化维持以及主动去甲基化的动态调控所实现的，这些过程受到多个酶的催化，并且受到不同调控通路的调控。本综述主要讨论了植物中的DNA甲基化，包括甲基化和去甲基化酶以及调控因子，还有一个甲基化和去甲基化共同协作的机制（甲基化稳态调控）；DNA甲基化对于转座沉默、基因表达及染色体互作的作用；DNA甲基化在植物发育中所扮演的角色；以及DNA甲基化参与植物对生物及非生物胁迫的响应。

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Introduction

5号位置胞嘧啶的DNA甲基化作用于核基因表达的表观调控及基因组稳定性。包括DNA甲基化、组蛋白修饰、组蛋白变异及一些非编码RNA改变在内的表观变化会影响染色质结构，进而影响遗传信息的可接近性。因此，DNA甲基化对于许多生物学过程是非常重要的，破坏DNA甲基化能够导致动植物发育不正常，比如西红柿果实成熟、老鼠胚胎致死等。
DNA甲基化在动植物中十分保守，基因组DNA甲基化精细模式对于发育是非常重要的。在动植物中，DNA甲基化由保守的DNA甲基化转移酶利用S-腺苷甲硫氨酸作为甲基供体进行催化，而主动DNA去甲基化则涉及到一个碱基切除修复机制。一个由RNA指导的DNA甲基化通路对于植物中的从头甲基化至关重要，但在哺乳动物中却不是很重要。与哺乳动物相反，哺乳动物中的主动DNA去甲基化由5-甲基胞嘧啶（5-mC）的氧化作用和脱氨作用起始，而植物则利用5-mC DNA糖基酶直接切除5-mC碱基。

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一个特异性DNA甲基化状态反映了甲基化建立、维持和主动去除的动态调控的结果。这些过程受到多个酶的催化，并且由不同通路靶向到特异性基因组区域。植物DNA甲基化发生在所有的胞嘧啶序列上，包括三种类型，即CG、CHG和CHH，其中H代表了A、T或C。在拟南芥中，全基因组范围的DNA甲基化特征主要是异染色质中的高度甲基化，主要富集在转座子元件和其他类型的DNA重复序列上。散在分布转座子相关的DNA甲基化同样在真核生物染色体臂上存在。

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在植物中，从头DNA甲基化是由RNA指导的DNA甲基化通路（RdDM）所介导的，除了一系列的蛋白还涉及到了小干扰RNA（siRNA）和支架RNA（图1）。根据目前对于拟南芥中经典的RdDM通路理解，24核苷酸siRNA的产生是由RNA聚合酶POL IV通过转录起始的，起始后由RNA依赖性的RNA聚合酶RDRP2（也叫RDR2）进行转录本拷贝以形成双链的RNA（dsRNA），再由类DICER蛋白DCL3将dsRNA剪切成siRNA。这些siRNA会装载到AGO蛋白上，主要是AGO4和AGO6，然后通过与支架RNA互补配对，这些支架RNA是由POL V. AGO4与DNA甲基转移酶DRM2互作产生的，进而通过一种不依赖于序列的方式催化从头甲基化。该反应可能由RDM1所协助，该蛋白可同时关联AGO4和DRM2，还可能能够结合单链的被甲基化的DNA（图1）。

ReDM

RNA介导的DNA甲基化.jpg

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除了siRNA和支架RNA之间序列特异性的配对外，AGO4和NRPE1及RDM之间的蛋白互作对于RdDM也是非常重要的。NRPE1是POL V最大的亚基，而RDM3是POL V相关的转录延伸因子。POL V转录的ncRNA肯定保留在染色质上，作为支架RNA发挥功能，这个过程可能受到了RRP6L1的促进，RRP6L1蛋白是酵母和哺乳动物核糖体RNA加工RRP6蛋白的同源物，主要作用于RNA保留。另外，IDP复合物能够稳定siRNA与支架RNA之间的配对，IDP结合RNA，并与SWI/SNF染色质重塑复合物互作，该复合物主要包含SWI/SNF复合物亚基SWI3B，并参与POL V介导的核小体位置改变引起的转录沉默。

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预先存在的染色质修饰可以促进招募POL IV和POL V到RdDM的靶向位点。POL IV由SHH1蛋白招募，该蛋白通过本身的Tudor结构域结合二甲基化的组蛋白H3赖氨酸9（H3K9me2）。SHH1还能够与CLSY1互作，而CLSY1蛋白是与POL IV相关的染色质重塑蛋白，并且对于POL IV-依赖性的siRNA合成是必要的（图1）。POL V与染色质之间的关联生成支架RNA这个过程需要染色质重塑DDR复合物，主要由染色质重塑蛋白DRD1、染色体结构维持蛋白DMS3和RDM1构成（图1）。DDR复合物物理上能够与SUVH2和SUVH9互作，这两个蛋白是属于SU(VAR)3-9组蛋白甲基转移酶家族蛋白的成员，但缺失足蛋白甲基转移酶活性（图1）。SUVH2和SUVH9通SRA结构域识别甲基化的胞嘧啶，对于POL V在全基因组范围染色质上的正确分布是必需的，因此被认为通过预先存在的DNA甲基化来招募POL V。然而，通过锌指将SUVH9栓到未甲基化的DNA上已经能够招募POL V，并建立起DNA甲基化和基因沉默。

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既然POL V能够在同一位点产生带有不同5ʹ端的ncRNA，貌似起始转录的过程并不依赖于启动子。全基因范围的POL V或POL IV染色质分布图谱并未发现一致的启动子基序。一些POL V转录的ncRNA在5ʹ端具有7-甲基鸟苷的帽子，显示POL V产生的转录本可以适用于一些已知的用于修饰POL II转录的mRNA加工过程。然而，POL V产生的转录本在3ʹ端缺少多聚腺苷酸，因此与mRNA不同。与POL V转录本足够长能够被常规的PCR检测到不一样，POL IV转录的ncRNA（P4 RNA）大多只有46-50个核苷酸，因此只有近期对拟南芥的dcl三突和四突植株采用小RNA深度测序检测到了这一类ncRNA，这两个突变体植株中POL IV依赖性和RDR2依赖性的dsRNA剪切成24核苷酸siRNA可能失效了。P4 RNA在dcl三突植株中积累，而且可以被外源的DCL3处理成24核苷酸siRNA。因为P4 RNA非常小，每一个24核苷酸siRNA都可能来自于一个P4 RNA前体的切割。

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除了经典的POL IV–RDR2–DCL3通路产生24核苷酸siRNA，这些蛋白的旁系同源物同样可以通过非典型RdDM通路产生siRNA（图1）。POL II介导的转录不仅可以产生24核苷酸siRN和支架RNA，同时还能在某些RdDM靶向位点招募POL IV和POL V促进siRNA的产生。POL II与POL V相比，能够与不同的AGO蛋白有空间上不同的联系。在反式激活siRNA基因和一些转录激活转座子区域中，相比于POL IV和RDR2，RdDM更加依赖于POL II和RDR6。由DCL2和DCL4产生的21核苷酸或22核苷酸或者由DCL2产生的24核苷酸可以影响RDR6依赖性RdDM。

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拟南芥中的siRNA大多数是24核苷酸的，在dcl四突变体植株中几乎完全消失；然而，RdDM靶区域大约三分之二的DNA甲基化仍然保留，表明存在不依赖于DCL的RdDM存在，可能由一些不依赖于DCL的siRNA或直接由P4 RNA所介导（图1）。除了DCL蛋白外的RNase III酶能够切割dsRNA，并且在野生型植株中，RNase III酶可能与DCL蛋白一同发挥作用，将POL II、POL IV或POL V转录本加工成siRNA。

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遗传筛选已经鉴定了一些mRNA前体剪切因子，这些因子突变掉会不同程度地降低POL IV依赖性siRNA的水平，而这些剪切因子是如何影响siRNA的水平暂时还不清楚。比如说，STABILIZED 1和RDM16这两个剪切因子的突变会降低POL V依赖性支架RNA的积累。据推测，一些能够结合mRNA前体的剪切因子可能会跟由POL IV和POL V产生的非编码转录本结合，并影响它们的加工或是稳定性，进而影响siRNA或支架RNA的丰度。

Maintenance of DNA methylation

植物甲基化的维持取决于胞嘧啶序列的组成，由受到不同机制调控的DNA甲基化转移酶催化（图2）。CG胞嘧啶甲基化由MET1维持（图2a）。MET1是哺乳动物DNA胞嘧啶-5-甲基转移酶DNMT1的同源物，主要在DNA复制后识别半甲基化的CG二核苷酸，并且甲基化子链上未被修饰的胞嘧啶。与人类和老鼠的DNMT1相比，拟南芥的MET1缺少富含半胱氨酸的CXXC结构域，该结构域被认为有助于帮助DNMT1区分半甲基化CG和未甲基化CG。哺乳动物中，DNMT1由E3泛素蛋白连接酶UHRF1所招募，与此类似，植物中的MET1由VARIANT IN METHYLATION蛋白招募到DNA上，该蛋白是UHRF1的同源物，对于维持CG甲基化是必需的。

植物DNA甲基化的动态调节.jpg

拟南芥中CHG甲基化的维持由DNA甲基转移酶CMT3所催化，另还有少部分由CMT2所催化（Fig2a）。玉米CMT3同源物MET2A的蛋白结构显示其bromo毗邻同源域（BAH）及chromo域结合到H3K9me2。阻止CMT3-H3K9me2之间的互作不仅能破坏CMT3结合到核小体上，还能导致CMT3活性的完全缺失。拟南芥H3K9特异性甲基转移酶SUVH4及其SUVH5、SUVH6的突变会基本废除H3K9me2，并大幅降低CHG甲基化水平。甲基化的CHG由SUVH4的SRA结构域所结合，并招募它进行H3K9甲基化。因此，甲基化的CHG和H3K9me2修饰通过反馈调节通路相互增强（图2a）。

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CHH甲基化由DRM2或者CMT2所维持，取决于所处的基因组区域。DRM2维持RdDM靶向区域的CHH甲基化，这些区域主要集中在演化上比较年轻的转座子、短转座子以及一些常染色体臂上的其他重复序列，同时还有通常出现在异染色质区域的长转座子的边缘区域。相反，由CMT2催化的CHH甲基化主要在含组蛋白H1异染色质区域，而这些区域不存在RdDM。DDM1的突变会破坏由CMT2催化的CHH甲基化，DDM1是一种染色质重塑蛋白，该蛋白同时对于维持对称胞嘧啶序列处的DNA甲基化也是必需的。非对称甲基化的维持可能也会受到MET1和CMT3的影响，因为MET1依赖性的甲基化同样可以被SUVH2和SUVH9所识别以在某些RdDM位点招募POL V，另外CMT3依赖性的CHG甲基化增加了H3K9me2的水平，进而促进了CMT2催化的非CG类型甲基化。尽管CHH胞嘧啶仅仅可以被DRM2和CMT2所甲基化，但这两个酶也可以在其他序列类型上甲基化胞嘧啶。

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Active DNA demethylation

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缺少甲基化转移酶活性或者DNA复制后缺少甲基供体会导致未能持续维持甲基化，也就是所谓的被动DNA去甲基化。DNA甲基化也可以通过酶的方式来擦除，也就是主动DNA去甲基化。与DNA甲基化反应受到单个DNA甲基化转移酶所催化相反，主动DNA去甲基化需要一系列的酶来实现，而起始这个过程的酶就叫做DNA去甲基化酶。在植物中，一类具有双功能的5-mC DNA糖基化酶-脱嘌呤/脱嘧啶裂解酶家族通过碱基切除修复途径来起始主动DNA去甲基化（图3a）。哺乳动物中的主动DNA去甲基化也涉及到一个DNA糖基化酶，同时也有剪辑切除修复机制参与其中。然而，植物DNA糖基化酶可以识别并直接移除5-mC碱基，而在哺乳动物中，5-mC必须先经过氧化，然后才能被DNA糖基化酶所催化、移除。

拟南芥双功能5-mC糖基化酶基因家族有4个基因，分别是沉默抑制子ROS1、转录激活子DME、类DME蛋白DML2以及DML3，这些酶能够识别所有序列类型的胞嘧啶并切除5-mC。ROS1、DML2和DML3在所有的营养器官中均有表达，而DME优先在雌雄配子的伴细胞中表达，也就是雌配子体的中央细胞和雄配子体的营养细胞。
在DNA去甲基化过程中，这些双功能酶起先作为DNA糖基化酶水解碱基和脱氧核糖之间的糖基键，然后作为脱嘌呤或脱嘧啶裂解酶去切段DNA链，产生一个无碱基位点（图3a）。5-mC碱基的切除跟随着β-消除或β,δ-消除反应，会形成一个以3-磷-α,β-不饱和醛或3磷酸为结尾的缺口。随后，脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶DNA-(无嘌呤或无嘧啶位点)裂解酶APE1L和DNA磷酸酶多聚核苷酸3ʹ-磷酸酶ZDP在β-消除或β,δ-消除反应的下游发挥作用以生成一个3ʹ OH基团，进而缺口能够被DNA聚合酶和连接酶所填充（图3a）。拟南芥DNA连接酶LIG1的亚细胞共定位与ROS1、ZDP和APE1L一致，且对于胚乳组织中母本印迹基因FWA和MEA的去甲基化和激活是必需的，这些证据显示LIG1可能是主动DNA去甲基化通路中发挥作用的连接酶。

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ROS1在体外能够在特异性的靶位点上随机滑动，但在细胞内，DNA去甲基化酶存在靶标特异性，主要取决于不同的染色质特性和招募的蛋白。由DME介导的去甲基化则偏爱常染色质区域小的、富含AT的转座子，继而导致邻近基因表达量的改变。ROS1同样靶向转座子，进而倾向于在基因附近。这说明由ROS1介导的去甲基化有助于在转座子和基因之间建立边界，预防来自转座子的DNA甲基化和转录沉默扩散。ROS1也部分作用于抵消由RdDM通路建立的DNA甲基化，尽管ROS1也去甲基化非RdDM依赖性的区域（图3b）。对于RdDM中控制靶位点特异性的小RNA是否在ROS1靶向特定位点的过程中发挥作用还不清楚，尽管RNA结合蛋白ROS3对于一些ROS1依赖性基因组区域的去甲基化非常重要。ROS1靶向转座子和其他一些富含乙酰化的H3K18和H3K27me3的基因组区域和一些没有H3K27me和H3K9me2的基因组区域。

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ROS1靶向某些基因组区域是由抗沉默蛋白复合物IDM所介导的，该复合物包含IDM1、IDM2、IDM3、MBD7、HDP1和HDP2（图3a）。IDM2是一个含α-晶状体结构域的蛋白，其能够与IDM1发生互作，同时对于植物中IDM1依赖性的H3K18乙酰化是需要的。MBD7优先结合到高度甲基化的CG致密区域，物理上能够与IDM2互作，同时也能够与IDM2的同源物IDM3互作，而IDM3也能够与IDM1发生互作，MBD7作用于防止基因被抑制和DNA超甲基化。尽管IDM复合物被认为能够保证IDM1靶向甲基化的DNA位点，而IDM1催化的组蛋白乙酰化是如何招募ROS1来进行DNA去甲基化的仍然还不是很清楚。