Single cell RNA-seq data analysis with R视频学习笔记（六）

第六讲：降维Dimensionality reduction (PCA, tSNE and UMAP)
视频地址：https://www.youtube.com/watch?v=qcLJ_JO6bn8&list=PLjiXAZO27elC_xnk7gVNM85I2IQl5BEJN&index=6

这一讲里，主讲人将介绍三种降维的方法（PCA, tSNE and UMAP），但是关于原理部分（一堆数学公式）他就不细说了（其实我也不想听）。

在你做完测序以后，你会得到reads counts，然后你要做QC来质控一下。之后标准化。接下来你要做降维，PCA或者CCA（CCA在前一讲里说过了），这里取决于你要干什么，如果你要整合数据，那么就要做CCA；如果仅仅是分析你的一个dataset，那么一般就是PCA。然后就是tSNE/UMAP、聚类，最后是差异基因。作为单细胞测序的流程，你有很多的options。如果你已经知道了你的classes，你都不用做降维，可以直接从标准化跳到差异基因，或者直接做轨迹分析。你也可以从PCA跳到聚类。这完全取决于你的dataset和你的需求。主讲人不会一一介绍。但是，中间那个分析流程是最经典的。

那么问题来了，为什么要做降维呢？说白了，就是简化你数据的复杂性。比如你的矩阵里有好几千个基因，然后你把它们降至二维，把非线性转化成线性，这非常有利于你的后续分析，尤其是clustering。其次，把你的数据“去冗余”。因为很多基因都与其他基因有关联，你不需要去解释你的不同样品里几千个基因的变化。第三，发现你数据里与condition最相关的信息。第四，减少下游分析的时间。第五，方便聚类。

降维的算法大致可以分为2类或3类。这一讲主要介绍其中3种。

首先是PCA。这是一种线性代数的降维方法。

PCA利用奇异值分解(SVD)方法进行数据压缩，上图是对PCA的一个说明。你的M矩阵，可以被分解成好几个矩阵，一个就是U矩阵，这个矩阵是所有的基因和主要成分之间的关系，可以代表每一个基因对于主要成分的重要性。还有一个矩阵就是V矩阵，是每一个样品对于主成分的重要性。如果你查看主成分对象（上图右下角），你会发现有两个矩阵，分别是U（rotation）和V（x）。

这个主讲人把PCA讲的有点复杂了，我还是喜欢前一讲里那个人举的例子（鱼的例子），非常的简单明了（Single cell RNA-seq data analysis with R视频学习笔记（四、五））。

上图里可以看到，主成分1里储存了更多的variation，大概占了你data里的98%的variation。而主成分2只占了2%。所以主成分1可以解释你数据里的98%的variation。假设你的dataset里有2万个基因，那么主成分1在这里就可以解释你数据里50%的基因（取决于你的data是什么样的），这也就可以把你的data进行去冗余了。而主成分2在这里基本上没有提供什么有效的信息，所以如果你的PCA也像这样，你完全可以忽略主成分2的影响。

在单细胞测序里，你可以根据里的主成分来判断细胞的类型。有时候主成分会捕捉到你的gene pattern。但有时候，如果你有两个测序文库，主成分会捕捉到你的“测序深度”。有时也会捕捉到“异质性”，特别是你的样品里有红细胞的时候，红细胞相比于成纤维细胞或其他细胞，它没有很多的RNA，所以这时候PCA不仅会根据你的gene pattern来区分细胞，还会根据RNA的量来把细胞分开。比如上图左下角，top 2两个基因对主成分1 的影响是最大的。在右下角的图里，你可以看到哪一个基因真正corresponding一些细胞，然后把这些细胞分到主成分1里。

上面是对PCA的一个总结，不难理解，就不多做说明了。缺点是在单细胞测序里，dataset很多都是0，会影响你的PCA结果。另外细胞大小和测序深度也会被PCA捕捉到，但这通常不是你想看的。所以最好是用非线性降维方式来处理单细胞测序dataset。

在讲解非线性降维之前，主讲人想先讲一下什么是graph（图形）。因为tSNE就是基于graph原理来的。在graph里，每一个蓝色的点是一个细胞，也可以是一个基因。蓝点之间的黑色粗线就是两个细胞之间的connection。有粗线的两个细胞说明他们在多维空间里的距离很近，是高度相关的。这样就可以把你的data很形象的表示出来。并且这种相关性是可以被量化的。很多非线性降维方法都是基于这个概念设计的。这里分为两步：（1）根据k connection建立一个加权图，也叫KNN。（2）把你的Data低维度嵌入这个加权图。举个例子，图里有13个蓝点，也就是说你的矩阵13*13，你要把它们降到二维，也就是x和Y。这个过程就叫“嵌入”。

现在来看看tSNE。

首先，tSNE是一种非线性的降维方式。上图比较形象：一般来说你的数据在多维空间里并不是线性分布的，比如说是一种“流形”的空间结构，而不是平面的（因为平面是二维）。所有的细胞组成了一个“卷”，然后看两个白色的点，代表其中两个细胞。如果你用PCA来计算两个白点之间的距离，那么蓝色的直线就是他们之间的欧式距离，是线性的。但是tSNE寻找的是白色点临近的细胞（neighbor），但是这个图里，两个白点的直线距离内没有细胞。而离它们近的则是沿着红色线方向的细胞群，而红色线就是tSNE方法里两个白点的空间距离。

现在来看看tSNE是怎么做的。怎么确定你降维后的两个细胞的空间距离，可以对应多维空间里两个细胞的空间距离呢？上图左边，这是你的所有的细胞在多维空间里的分布。你想把左边的多维空间，投影到右边的二维上。它是利用一个叫t-distribution来做的。比如左边的i细胞为中心点，那么离它很远的点都不会被考虑为“nearest neighbor”，因为那些点的t-distribution是接近于0的（右下角的图，峰的两侧趋近于0的位置是那些离i很远的细胞所拥有的t-distribution值）。而j细胞是i的"nearest neighbor"，无论在多维还是二维，j是i的“最近的邻居”的“可能值”都是最高的。

举个例子：上图左边，我们有两个基因，3个细胞群。我们想把二维降到一维，也就是线性。那么刚开始（右图），细胞是随机分散在一条线的，然后根据几次的重复，计算最邻近的“邻居”，相同颜色的细胞逐渐的被分到一起，这就是tSNE的concept。需要注意的是，在tSNE里，相对于较远的细胞群（比如红色和蓝色，红色和绿色），并不能说明哪一个群离红色细胞更远，所以不能根据tSNE图上的细胞群的距离来判断两个群是否更接近或者更不接近。

这里有需要注意的点：（1）与PCA不同的是，tSNE是一个随机的算法。在你进行PCA分析时，无论你跑几遍PCA，你总能得到相同的图。而对于tSNE来说，每一次你跑tSNE的时候，图都是不一样的。如果你想要你的结果是可重复的，你需要设置“seed”，就是“种子”，以这些种子为中心进行计算，这样你的data才可以重复出来。（2）与前一张PPT讲的一样，上图右边，黑色箭头所标注的细胞群的形态在每次tSNE运行结果里是conserved的，而这个群与其他群的相对位置在每次运行tSNE后却是不一样的，这是因为tSNE并不能解释farthest距离，所以图里的两个不同群的相对位置是没有意义的，不能拿来比较。（3）如果你想加样品，比如你想把其他人的dataset和你的结合在一起分析，请重头分析。

这是tSNE的一个总结，就不多说了。（这里有人问tSNE是不是聚类的方法，主讲人说不是，这只是一个降维的方法）

下面讲的是UMAP。

UMAP是一个比较新的方法，它是一种基于拓扑结构的方法。什么是拓扑结构？主讲人说，简单的理解：拓扑结构就是一个"surface"（面）。所以如果你three dimensions， 你就可以构成一个“球形”，或者是“正方形”，在这里是一个“四面体”。这个四面体就代表了4个样品在多维空间里的结构。与tSNE不同的是，UMAP不是随机的，而是根据拓扑结构来计算距离的。

再来看看这个图，还是两个基因，3个细胞群。UMAP与tSNE不同的是，UMAP考虑的不仅仅是每个细胞群的内部，它还要考虑整体的情况，比如红色和蓝色群，红色和绿色群。这有什么好处呢？说明不管你跑几次UMAP，甚至是只跑你的dataset的部分数据，你会得到非常相似的结果。当然，这不是说我们就不能用tSNE了，还是有很多人习惯用tSNE的。有时也很难说哪一个更好，只能说哪一个可以给我们更好看的结果，完全取决于你的dataset。

至于运算速度：UMAP在处理大量数据的时候（大于10^5个细胞的时候），它的速度慢于其他降维方法。

这是UMAP的总结。

最后这张PPT说的是不同的包里包含的降维方法，可以看到三大R包Seurat v3, Scater, Monocle v3都包含PCA、tSNE、UMAP。所以用哪一个还是看自己的习惯。