如何利用单细胞测序研究乳腺发育分化

乳腺上皮细胞（mammary epithelial cells，MECs）结构特征以及发育过程中如何受到调控，对于理解乳腺癌发生至关重要。

本研究利用单细胞转录测序（Singlecell RNA sequencing, scRNA-seq）确定不同发育时期MECs基因表达情况，构建MECs细胞动态图谱，为成人乳腺发育过程提供认识和见解。

研究材料

对来自四个发育时期，分别是未怀孕时期（NP）、妊娠期第14.5天（G）、哺乳期第6天（L）和完全自然退化期第11天（PI），共23,184个MECs，进行10xGenomics单细胞转录组测序(scRNA-seq)­。

研究思路

研究结果

1 scRNA-seq确定15个MECs亚群

选取四个时间点：NP、G、L和PI，每个时间点取两只小鼠，利用上皮特异性粘附分子（EpCAM）分选MECs。将制备好的细胞悬液用于10x Chromium平台，随后进行scRNA-seq（Fig1a）。聚类分析将23,184个细胞分成15个细胞亚群（C1-C15）， 基于Krt18, Krt8, Krt5, Krt14 和Acta2的表达水平，11个亚群（C1-C11）表现出管腔细胞特征，4个亚群（C12-C15）表现出基底细胞特征（Fig 1b-d）。

为了进一步描述不同亚群的特征，作者确定亚群差异表达基因，然后根据已知分子标记推测亚群假定特性。结果显示，大多数亚群为相同假定细胞类型。这些细胞表现出高度的相似性，表达相同的标记基因，但来源于不同的发育阶段（Fig 2a），暗示乳腺的发育阶段对某些细胞类型的转录环境有特定的影响。

管腔细胞类型发现了两个较大的细胞亚群，C1-C5表现出hormone-sensing细胞（Hs）特征，例如激素受体（Pgr, Esr1, Prlr）表达水平高；C6-C11则表达较低的激素受体（Fig 2a-c）。基底细胞类型中，C14表现出肌上皮细胞特征，C15表现出Procr+基底细胞特征，与乳腺再生有关（Fig 2b、2c）。

Fig 1 MECs细胞亚群分类

Fig 2 推测MECs亚群特征

2 管腔细胞分化层次重建

接下来作者选择NP和G时间点的细胞，研究乳腺上皮分化状态。利用diffusion maps计算重建细胞分化状态，该方法将数据导入低维空间中，细胞间的距离代表渐进但随机的过程。

结果显示，管腔细胞和基底细胞亚群显示出明显的分离，但这两种细胞间没有过渡状态（Fig 3a），这一结果支持假设：在正常组织自稳态中，两种细胞系基本上是自我维持的。与此相反，管腔细胞显示出明显的结构，不同亚群和相同起源的细胞之间存在逐渐过渡（Fig 3b）。

作者发现，随着细胞逐渐从共同起源中分离出来时，祖细胞标记分子Aldh1a3表达水平逐渐减少。并且，分化的轨迹终止于C8，表现出Csn2 和 Glycam1的表达上调（Fig 3c），与分泌表型一致。左侧分支中，在C6和C8之间，大部分细胞来源于C10；右侧分支中，细胞从C6过渡到C2、C4/C5，期间Esr1 和 Pgrincreased 表达上调，暗示这一分支向hormone-sensing管腔细胞分化（Fig 3b、3c）。

Fig 3 计算重建乳腺上皮细胞分化过程

3怀孕时腔室祖细胞向肺泡细胞分化

以上结果阐明了在妊娠周期中，乳腺的细胞组成如何发生改变。作者利用差异表达基因将C6与其他腔室区分开，分析它们是否表现孕后腔管祖细胞C7的特征。

结果显示，C6和其他腔室的差异表达基因与C7和其他腔室的差异表达基因表现出相同的趋势（Fig 5a）。相较于C6，在C7上调表达基因显著富集在与免疫响应和乳汁分泌信号通路（Fig 5b）。在C1中也存在这些上调基因，某些基因甚至出现在C3亚群中，但是在祖细胞上调是最显著的（Fig 5c、5d）。

最后，通过分析细胞从PI到NP和G时期的轨迹图，比较未怀孕时期与妊娠期腺体的腔室分化过程。结果显示，C1和C3保持未怀孕时期的分化位置，而C7则从起点延伸到肺泡分支，表明其偏向肺泡的分化命运（Fig 5e），这和乳汁产生和分泌相关基因过表达的结果一致。

这些数据表明，腔管祖细胞持有妊娠和哺乳的记忆，这种记忆可能是祖细胞分化到肺泡，促进怀孕时期的肺泡生成。

Fig 4  怀孕对腔室祖细胞转录作用的影响

小结

①文章利用scRNA-seq得到跨越四个发育时间点的数万个乳腺上皮细胞转录组数据，分析确定了15个细胞亚群，其中一些仅在特定发育阶段存在。

②通过对细胞分化过程重建，以高细胞分辨率描述分化过程，结果不仅支持前期乳腺研究领域形成的一些假设，也为后期了解腺体中不同细胞类型之间的关系以及乳腺癌的发生发展提供基础。

③scRNA-seq旨在解析细胞的发育过程，揭示分化过程中的基因表达动态变化，可应用于不同类型的细胞发育研究，如神经系统、干细胞、胚胎细胞等。

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