无需假病毒！检测新冠抗体中和能力的两种方法

尽管RT-PCR检测病毒RNA技术，已经成为大多数国家和地区对新冠患者排查的常规手段，也是COVID-19病例诊断的金标准，但仍然需要血清学方法来表征SARS-CoV-2的体液反应。血清学检测可以用来追踪已经清除感染的个体（尤其是轻度或无症状个体）的传播，有助于了解病毒的流行病学，并将新冠免疫人员布置在医院的关键前线位置。同时，评估新型疫苗临床研究效果也必须通过血清学方法验证。SARS-CoV-2是有包膜的单链RNA病毒，包含四个结构蛋白：膜（M），包膜（E），刺突（S）和核衣壳（N），其中N和S蛋白是最具免疫原性的病毒抗原，而只有S特异性抗体才能介导病毒中和。因此，针对S蛋白的特异性抗体反应是血清学检测的首选参数。在这里，小编分享两种无需使用中和抗体检测商业试剂盒或产品也能检测新冠抗体中和能力测定的方法。

1、抑制细胞融合测定法

稳转表达β-半乳糖苷酶的α亚基的293T细胞瞬转SAR-COV-S蛋白基因，稳转表达编码β-半乳糖苷酶的ω亚基的293T细胞瞬转人ACE2基因，转染后2天，将表达S蛋白的细胞和表达ACE-2的细胞以1：1的比例混合，同时加入待测试的抗体样本，并在37℃下孵育3小时后，-80℃冻融裂解细胞，用化学定量法检测β半乳糖苷酶活性。（图1）

图1 抑制细胞融合测定法原理

如图2所示，将表达S蛋白的细胞与不同的Ig抗体一起孵育，并与表达ACE2的细胞混合后，测定报告基因β-gal的活性作为细胞融合的指标。用实验数据的最佳拟合曲线计算IC 50值。其中ACE2-Ig有效抑制SARS-CoV-2 S蛋白介导融合，IC 50值为0.65μg·ml -1。mACE2-Ig对SARS-CoV-2的IC 50值0.48μg·ml -1。对照TIGIT-Fc在该测定中未显示任何抑制作用。表明ACE2-Ig和mACE2-Ig均表现出对SARS-CoV-2 S蛋白的有效中和活性。

图2 2种Ig抗体有效地抑制了SARS-CoV-2-S蛋白表达细胞与ACE2蛋白表达细胞的融合

同理，今年清华大学报道，用双荧光素酶作为报告基因的细胞融合实验，测试了两种单克隆抗体对登革热病毒感染的抗细胞融合活性（图3）。证明无需β半乳糖苷酶试剂，双荧光素酶也可以作为细胞融合实验的报告基因。

图3用双荧光素酶作为报告基因的细胞融合实验原理

2、流式检测法

只需要准备表达病毒抗原的工具细胞株、检测IgG或IgM的流式二抗、中和抗体标准品或抗原配体的标准品即可开展实验。而且流式可以圈出目标细胞继续后续定量分析，因此比间接法的细胞融合实验更灵敏。经PCR确诊的SARS-CoV-2感染患者标本中，与市售的化学发光免疫分析CLIA和ELISA检测试剂相比，对201 COVID-19血清的分析灵敏度最高。

表1比较3种方法检测COVID-19 PCR阳性患者的血清样品抗体的灵敏度

pCG1_CoV_2019-S质粒：编码密码子优化的SARS-CoV-2 S重组蛋白序列（带有跨膜区）；pcDNA3.1质粒用于模拟转染对照。蓝色荧光蛋白（BFP）和红色荧光蛋白编码质粒（dsRed）用作转染的293T细胞的标记蛋白；293细胞用CoV-S和荧光蛋白（BFP）瞬转后作为工具细胞，将pcDNA3.1和15μg荧光蛋白（dsRed）瞬转后作为内部对照细胞。转染后48小时，收集细胞，以1-ml等分样的形式让细胞在− 80°C下保存。检测前，将等分试样的细胞解冻，重悬于FACS缓冲液中。将每个样品（S蛋白工具细胞和模拟转染对照细胞）中的每个样品的0.5×10^5个细胞接种到96孔板中，加入标准品或待测样品的梯度稀释液，4°C孵育30 min。用流式缓冲液洗涤两次，加入流式二抗染色（30分钟，4°C，抗IgG-AF647；抗IgM-BV711）。PBS洗涤两次，然后重悬于流式缓冲液中以进行流式细胞术分析。

图4流式检测血样的新冠抗体

将表达SARS-CoV-2S蛋白的293T细胞和pcDNA3.1转染的细胞（模拟物）与COVID-19患者血清（S1-S3）或阴性对照血清（S4–S6）一起孵育）。左图显示了将共转染的荧光蛋白作为转染标记（BFP和dsRed）的细胞群的画门。右边的直方图分别描绘了两个细胞群在每个样品中的IgM和IgG荧光信号。

图5通过ACE-2-Fc标准品对样本中的SARS-CoV-2抗体进行流式定量检测

（A）用ACE-2-Fc标准品做流式检测，用来确定标准血清的ACE2浓度。

（B）用流式细胞术检测标准血清。曲线拟合生成用于未知样品绝对定量的标准曲线。

（C）EuroImmun ELISA检测标准血清。曲线拟合生成用于未知样品绝对定量的标准曲线。

（D）通过ELISA和SARS-CoV-2特异性IgG的细胞流式检测，对7份COVID-19患者血样的新冠抗体进行定量。

总结一下，抑制细胞融合法需要准备编码抗原和配体的2种工具细胞株、中和抗体标准品和β半乳糖苷酶试剂盒。流式法只需要准备表达病毒抗原的1种工具细胞株、检测IgG或IgM的流式二抗、中和抗体标准品即可开展实验，而且流式可以圈出目标细胞继续后续定量分析，因此比抑制细胞融合实验的精确度更高。