Cell—Engineering Quantitative Trait Variation for Crop Improvement by Genome Editing

结果（下）

Novelcis-Regulatory Alleles Can Immediately Be Fixed

在无转基因植株中新的顺式调控等位基因能很快被固定以达到对果实心室数目的一系列的突变

许多的F1植株有着增加的心室数目，这是一个很有希望的迹象，这些敏感的筛选在产生一系列缺失功能的等位基因上是成功的，这些缺失功能的等位基因将转化为连续性的果实心室数目变异。然而，考虑到F1植株已经从T0-2中带着一个强的丢失功能的CLV3启动子的等位基因，我们期待F1表型将出现比植物纯合严峻的纯合体，因为新诱导的等位基因。因此，去获得一系列定量的影响，我们专注于从有着强的和温和表型的24F1中分离出新的等位基因，PCR基因型表面这些植株都是双等位基因或嵌合体，带着大部分具有的新的缺失的等位基因。合适的，我们遗传流程的一个内在优势是在F1植株中新产生的等位基因能够被马上固定在无转基因的背景下在双等位基因的F2后代中以1/16的比率，和一个更低比率对嵌合体植株。我们使用来自一个温和的双等位基因的F1植株的后代来证明了这个分离。

为了更加丰富CLV3启动子等位基因去包含全方位的定量突变，我们鉴定了来自于一个带着强的和温和的有着等位基因多样性和心室数目变异的表型14F1植株子集的F2后代进行鉴定。来自于纯合的F2无转基因突体的启动子测序，F3后代对心室数目的影响上进行评价。我们发现所有的14个新的等位基因明显的，展示出一系列突变的内型，包括大的缺失，到位，小的插入和贯穿整个目标区域的点突变。最重要的是，这些等位基因的纯合突变，表型出连续性的心室数目变异。这个包括一个等位基因带着心室数目的微小增加与弱的功能获得性突变lcCR有相似的功能，另外两个等位基因(SlCLV3CR-pro-m6 and SlCLV3CR-pro-m8)与fas有着相同的表型。这些结果证明了具有很弱的定量影响的等位基因能够从温和和强大的F1植株中恢复，表明使用我们的方法能够设计已经存在和新的QTL突变。

Mutations

in Conserved cis-Regulatory Regions in the

在clv3启动子的保守顺式调控区域的突变和在转录水平的影响是表型改变的不良预测因子

我们利用clv3启动子等位基因的富集来表明特定的顺式调控突变如何影响心室数量的变异。尽管我们等位基因提供的方式对特定的CREs定义功能是不充足的，序列分析表明许多预测的在clv3启动子生CREs在14个等位基因被差异性的删除。成对的等位基因，如SlCLV3CR-pro-m13/SlCLV3CR-pro-m14

and SlCLV3CR-pro-m7/SlCLV3CR-pro-m11共享这重叠的缺失和相似表型的影响，这指出了假定的转录调控区域。为了更进一步理解这些和相似观察的重要性，我们比较番茄中的目标区域和三个茄科物种，从野生番茄pen，扩展到亲缘关系较远的tub和辣椒。两两序列的比对揭示了番茄和土豆在大小上从100到250bp的高度保守的4个区域，并有三个保守区域也发现在辣椒中。

尽管有些趋势是明显的，表型影响的等级不能容易的被预测从打乱的这些CR中。总的来说，最大的缺失表型出在心室数目上最大的增加，而带有小的缺失的等位基因有更微弱的影响。例如用于模拟编码区域突变的3个强大的等位基因中的2个共享着大的重叠破坏了全部4个CR的丢失。但是，SlCLV3CR-pro-m12是一个同等强烈的等位基因，这个等位基因长的1042bp的缺失除去了仅仅是CR4和侧翼的DNA序列。与此相反的是-m8更叫温和的影响，这个等位基因带着一个1408bp缺失和m12存在这重叠并移除了所有CR3和CR4和一部分CR2。

一个可能对这个和其他观察到的很少的联系的解释是在CREs和CRs上复杂的功能联系，包括可能的冗余，异上位性和功能补偿。另外，CREs预测在CRs之外，合适的组织和CREs的空间分布以及顺式调控元件模块对启动子的功能也是非常重要的。尽管额外的等位基因将需要来解析每个CREs的功能和他们的关系，我们对启动子等位基因的收集说明了在顺式调控区域的多突变如何能够导致出乎意料和不可预知的表型变化。然而，不同的等位基因导致在clv3表达上出现的相同变化也是可能的，和一些比较的表型效应上。在保守的CLV-WUS回路中，clv3肽结合表面LRR受体复合物中去开启一个限制wus表达和阻止茎细胞过度分裂的信号流。通过反馈调节，wus促进clv3的表达来限制自己的活性。考虑到这个反馈机制，我们评价了CLV3和WUS在14个启动子等位基因的生殖转变分生组织中的表达。引入注目的是，我们发现心室数目和这些基因的修饰转录平衡之间存在一些关系。例如，最强的等位基因中的两个在clv3表型上出现了戏剧性的减少，强表型的SlCLV3CR-pro-s6等位基因对CLV3没有影响，但是wus在这三个系中是上调的。更重要的是，和fas表型相似表型的SlCLV3CR-pro-m6表现出的clv3与wus的表达比率分别为22和1.5.这些和其他样品很可能反映出了那些潜在表明CLV-WUS负反馈回环的复杂的空间、时间、和生化调控机理。这些机理中的一个或多个在每一个等位基因中可能被改变了。综合起来，这些发现说明，CLV3的转录和表型之间并不是简单的线性关系，这也表明我们方法对分离新的带有一系列定量影响的顺式调控等位基因的优势。

CRISPR/Cas9 cis-Regulatory Mutagenesis Can Fine-TuneDiverse Traits

CRISPR/Cas9顺式调控突变体能精细调控多样化的性状

我们设计一个连续的对心室数目的定量突变能力依赖于对CLV3剂量敏感性的一个惊人水平。之前唯一的证据来源于fas。整体来说，与编码代谢酶的基因相比，发育的基因更加有可能存在剂量敏感性，因此这建议我们的方法应该被用来去对不同性状进行定量的突变。

我们通过靶向花序形态基因S和植株形态基因SP的启动子来检测我们的方法。这两个基因调控2个主要的产量性状。S通过促进分生组织成熟控制花序发育，编码区突变导致过度分支的带有成百朵花的花序。SP编码一个用于平衡成花素的成花基因家族的一个抑制子用于确保连续的新芽和花序通过‘不确定的’增长来生产。在SP上的一个经典的编码区突变提供了那种紧凑浓密的生长习惯。这种生长习惯对大规模的大田产量非常重要。

对两基因有限的等位突变使得改良这些性状变得很困难。纯合的S突变因为花粉不育导致低的可育性，但是杂合的因为剂量效应提供了中等的分支和改进的产量。然而，这个表型反应了一点可以沿着可能延续的花分支和花生产。对sp 这仅仅知道SP失去功能的等位基因，来说这情形是相似的。我们近期表明在那些调控2个发育过程的基因中，剂量关系能够被使用来创建新的一个花序和植株形态的能够转化为提高生产力的定量范围。然而，去创建特定更高的有顺序的纯合和杂合突变体组合的需求仍然是这种方法的确点。我们认为相似的结果仍然可以通过使用构建在S和SP启动子的顺式调控的突变体来更高效的获得。

我们使用我们多路复合的CRISPR/Cas9启动子编辑的方法靶向S并获得了3个在靶点区域带有不同大小缺失的T0植株。T0-2存在和s突变体一样的花序分支。我们我们杂交这个植株去建立和筛选326个激活的F1群体，其中的91（28%）表现为从弱到强的开花情况。有趣的是，我们鉴定了5个由于分生组织的大量过度增殖导致产生花椰菜花序的嵌合植株。这建议所有已知的s突变体可能不是空等位基因。从10个强烈和温和的F1植株的一小部分，我们发现了6个明显的启动子等位基因转变成一系列的花序分支。显著的，这包括一个和s/+杂合匹配的等位基因(SCR-pro-6) 与更温和表达的另一个等位基因。这表明对S剂量敏感性的高水平和CLV3相似。

成百的F1植物用于CLV3和S的敏感性筛选，但是对这两种情况，一小部分个体对分离提供一系列性状突变的等位基因是足够的。我们使用SP去检测是否结合小的筛选的T0植株驱动的等位基因将产生相似的结果。获得了4个T0植株，PCR基因型表明所以的为双等位基因或者是嵌合体，产生了不同大小的缺失。8个等位基因的测序表明所有的都是特别的，然而等位基因的一半分享这在靶点2和4之间的500bp的缺失。表明这些位点是更叫高效的靶点。我们计算了3个SP启动子等位基因的表型影响，这些等位基因通过恢复稳定纯合物无转基因从T0-3和T0-4派生出来。重要的是，这些CR-pro突变体表型出令人向往的修正过的地上形态，代表着几点沿着连续的植株形态，这之前是通过结开花途径中对个基因的稀有的编码区

突变产生的。为了扩大扩大SP顺式调控元件等位基因的数目，我们开创了对81F1群体进行了更小的筛选，其中的25株（30%）表明一系列的形态改变。这些个体的后代应该带着额外的等位基因为了这些主要的生成形状去扩大突变。共同的，这些结果表明我们的方法因为对各种基因或性状能高效的设计出令人需求的变异能够广泛的运用。