通过ATAC-seq和FAIRE-seq研究开放染色质发现驱动体内肿瘤发育的转录因子和调控区域

Davie K, Jacobs J, Atkins M, Potier D, Christiaens V, Halder G, Aerts S. Discovery of transcription factors and regulatory regions driving in vivo tumor development by ATAC-seq and FAIRE-seq open chromatin profiling. PLoS Genet. 2015 Feb 13;11(2):e1004994. doi: 10.1371/journal.pgen.1004994. PMID: 25679813; PMCID: PMC4334524.

增强子通过招募与之相结合的特定的转录因子来调控基因的时空表达，当转录因子与活跃调控区相结合的时候，相应区域的开放性增强，变成开放染色质区，从而调控基因的表达。那是否可以通过染色质开放性分析的方法对比正常生长的组织与处理的组织，借此寻找组织特异性表达相关调控区域呢？

2015年，PLos Genetics发表文章《Discovery of Transcription Factors and Regulatory Regions Driving In Vivo TumorDevelopment by ATAC-seq and FAIRE-seqOpen Chromatin Profiling》，作者就是以此为思路，利用ATAC-seq与FAIRE-seq的方法进行染色质开放性分析，通过对比野生型与不同肿瘤组织，并进一步鉴定出于与之相关调控区域与调控元件。

研究结果

1、ATAC-seq、 FAIRE-seq都能很好的鉴定出已知的增强子

黑腹果蝇的眼盘作为一种研究基因时空表达与细胞分化的模式系统已经被广泛应用。作者同样选择了黑腹果蝇的眼盘为研究材料进行后续实验。首先利用两个已被验证的增强子Optix  和oculis (so) 来对比ChIP-seq、DNAse-seq、ATAC-seq与FAIRE-seq四种方法的优良差异。结果显示在眼触角组织中，ATAC-seq、 FAIRE-seq都能很好的鉴定出两种已知的增强子，而在胚胎组织中，DNAse-seq并未检测出 (Fig. 1)。ATAC-seq与FAIRE-seq两种方法的 peak called 高度重叠，且相应峰高有着很强的相关性（Fig2A--D）。作者进一步验证了ATAC-seq与FAIRE-seq两种方法在鉴定启动子、增强子、绝缘子方面的都能发挥相应作用（Fig2E--G），两种方法对较，发现ATAC-seq方法的效果更加显著。

Fig 1. Enhancer identification in the eye primordium by ATAC-seq and FAIRE-seq. ( 通过ATAC-seq和FAIRE-seq识别眼睛原基中的增强子 )

Fig 2. Comparing general features of ATAC-seq and FAIRE-seq.（ ATAC-seq和FAIRE-seq 的基本特征比较）

2、ATAC-seq技术在染色质的开放性分析、被保护核小体鉴定等方面作用独特

在以CTCF为研究对象验证绝缘子过程中，ATAC-seq也可应用于解析转录因子足迹和核小体包装（Fig3）。在以往的研究中，在CTCF结合区域，ATAC-seq的信号降低，作者想要验证这种现象是否也存在于果蝇眼睛的形成中，作者发现在剪切位点上，CTCF的覆盖度明显下降，这表明，虽然这些区域通常都是开放的，但是CTCF保护蛋白阻止了其被切割，进一步阐明，高精度的ATAC-seq在鉴定调控区域中将会发挥重大作用。根据以往在体外对人体染色质的研究，ATAC-seq可以关联切割位点与核小体之间的距离，于是作者就评估是否对果蝇体内的小的样品进行ATAC-seq也可以获得相应信息。通过对比Buenrostro et al.的研究，作者惊喜的发现，即使在低至0.5M的reads读数的情况下，ATAC-seq依旧可以获得准确的结果。通过以上实验，证明了ATAC-seq技术在染色质的开放性分析、被保护核小体鉴定等诸多方面发挥了独特的作用。

Fig 3. Recovery of known enhancers and CTCF footprinting by ATAC-seq. （通过ATAC-seq验证已知增强子和CTCF足迹）

3、ATAC-seq、 FAIRE-seq可以鉴定肿瘤组织与野生组织中染色质开放性的变化

鉴于ATAC-seq、 FAIRE-seq的强大功能，作者以野生型与RasV12; scrib-/-癌症模式（致癌蛋白Ras过表达与scrib-/-隐形纯合突变）为材料进行研究，并通过对比早期肿瘤（RSE）、晚期肿瘤（RSL）与野生型开放染色质的差别，ATAC-seq结果显示有4851个峰的极速增加与4984个峰的降低。而且， ATAC-seq的结果相对于FAIRE-seq而言，变化更加剧烈，更加精细。通过信息分析，上调表达的基因与染色质区域的开放紧密相关，下调的基因与染色质开放度下降的区域相关。这就表明染色质区域的开放与关闭与整个基因功能的表达关系密切。作者以p53内的一个未知增强子为例证明了这个现象（Fig4）。总的来说，通过ATAC-seq、 FAIRE-seq可以鉴定肿瘤组织与野生组织中染色质开放性的变化，并且许多内源性的增强子和启动子的改变与基因的表达密切相关。

Fig 4. The tumor chromatin landscape. (肿瘤染色质图谱)

4、不同开放染色质对肿瘤发生的调控过程具有重要作用

已经获得调控区域的确切位置，作者利用i-cisTarget分析软件对9713个候选的转录因子motifs进行筛选，获得了AP-1、 Stat92E、 Scalloped、Zelda和  Brf.,其中AP-1和Stat92E两个TFmotifs 作为两个主要的调控元件。在活跃但并未改变的调控区，Stat92E并未富集而AP-1也只是微量富集（NES=2.7），这就表明富集只是特定发生于活性改变了的调控区域。引人注目的是，在诱导肿瘤生成的调控区，AP-1大量匹配（81%），这就意味着其在肿瘤生成中的诱发作用。AP- 1在JNK去磷酸化下游活跃，多个实验室已经证明在RasV12; scrib-/-肿瘤的发展过程中JNK与AP-1的重要性，抑制JNK信号或者敲除AP-1 都可以阻断肿瘤的扩张。Stat92E motif富集于较少的调控区而且高度覆盖了AP-1的应答区，这与已知的RasV12; scrib-/-化是一个协同的通路不谋而合（Fig5A、B）。

随后作者将野生型与不同肿瘤发育时期的活跃染色质区进行对比，探究是否随着肿瘤的发展，这些区域是否更加活跃。并根据不同的增强子开放程度讲增强子分成四组：Upd组（Upd过表达后开放的增强子）、Stable组（稳定开放的增强子）、ALL组（所有开放的增强子）、Gradual组（逐步开放的增强子）。作者发现，在Stable组，State92E富集高且高于AP-1，而在Gradual组，AP-1富集更加显著（Fig5C）。作者对这种现象也做出了一定的假设，一方面可能是因为State92E靶标活化早于AP-1或者小部分入侵的肿瘤也仍然具有State92E 活性。总的来说，在肿瘤发育时期基于不同开放染色质峰的motif分析推理提供了一个有效的途径来对肿瘤发生的调控过程的相关转录因子进行研究，本篇作者所得到的结果也证明了AP-1与State92E在RasV12; scrib-/-诱导肿瘤形成的下游发挥了重要作用。

Fig 5. Regulator detection by motif inference. （通过motif推断的调控过程）

5、StateE92在肿瘤化过程中发挥了重要作用

 作为JAK/STAT 信号通路的效应子，Stat92E被证明参与了改变染色质区域的过程。以往研究也显示当阻断JAK/STAT 信号通路，肿瘤症状被减少。然而Stat92E是如何直接参与这个过程的并没有被证实。作者构建了一个State92E突变的RasV12; scrib-/-肿瘤，发现肿瘤增长减慢（Fig6A--C），而且，State92E丧失功能的幼虫甚至化蛹，这在以往的实验中是从未出现。随后作者超激活JAK/STAT 信号通路，并将获得的材料命名为Upd。通过对比诱导肿瘤形成导致的染色质开放性变化与过表达JAK/STAT 信号通路，发现这些变化大部分具有相同的方向，但是过表达所引起的染色质开放性改变相较于诱导肿瘤生成较弱。利用ATAC-seq，诱导肿瘤生成的处理中检测的356个调控区，在过表达Upd中，72% 也有正向调控，说明这些调控区是State92E的效应区。而剩下的28%作者认为，这部分是AP-1的调控区，State92E在其中不发挥作用。随后作者想要知道这些调控区域的改变是否直接影响了基因的表达，作者在State92E的效应调控区上下游5Kb的范围内确定了28个潜在的目的基因。这其中有至少七个基因在JAK/STAT 信号通路发挥了重要作用（Fig6D--F）。由此，作者认为StateE92在肿瘤化过程中发挥了重要作用。

Fig 6. Validation of Stat92E as a key regulator during Ras V12 ; scrib -/- oncogenesis. （验证Stat92E作为Ras V12关键调控因子，- / -肿瘤形成）

6、总结

这篇文章一方面揭示了ATAC-seq、FAIRE-seq在开放染色质分析中的强大作用，尤其ATAC-seq方法更展现出更强的优越性，无论其更高 的信噪比、以及在转录因子足迹鉴定、转录因子鉴定等方面都展现出其独特优势。同时利用ATAC-seq鉴定了State92E、AP-1在肿瘤生成中的重要作用，进一步阐述了肿瘤生成的机理，为肿瘤研究提供了宝贵经验。

测序数据

ATAC-seq, ChIP-seq and FAIRE-seq data for all conditions are available in GEO (http://www.

ncbi.nlm.nih.gov/geo/), with accession number GSE59078.

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参考链接：http://www.igenebook.com/news/376.html