2021-12-05

Nat Methods | 实用指南：几种基于多重抗体的成像方法

原创 huacishu 图灵基因 2021-12-05 07:05

收录于话题#前沿生物大数据分析

撰文：huacishu

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推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

1、作者概述了基于多重抗体的成像，整理了关键资源，并概述了规划和执行多重蛋白质检测实验的注意事项，这些实验可以提供创建真实细胞和组织图谱所需的高分辨率空间背景；

2、此外，这些方法为细胞间相互作用、信号事件、蛋白质的亚细胞定位或翻译修饰提供了直接的见解。

欧洲分子生物学实验室（EMBL）Sinem Saka教授课题组在国际知名期刊Nat Methods在线发表题为“Spatial mapping of protein composition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-based imaging”的论文。组织和器官由不同类型的细胞组成，这些细胞必须协同工作才能发挥生理功能。创建这些细胞的高维生物标记物目录的工作主要基于单细胞测序方法，这种方法缺乏理解关键细胞联系和相关结构组织所需的空间背景。为了解决这个问题，最近发展了几种复合蛋白质成像方法。尽管这些技术在免疫标记和检测标签的策略和模式上有所不同，但它们通常利用针对蛋白质生物标记物的抗体来提供复杂组织的详细空间和功能图。本研究提供了必要的资源、获取可靠且可重复的成像数据的关键考虑因素，以及来自领域专家和技术开发人员的专业知识。

哺乳动物组织由具有独特功能属性和激活状态的多种细胞组成。许多现有的方法免疫组织化学（IHC）、免疫荧光（IF）、转录组学、质谱通过单细胞分辨率研究组织和器官系统来捕捉这种异质性和复杂性。所有这些方法都代表了空间信息和覆盖深度之间的权衡关系。基于流式方法，如多参数流式细胞术和质谱仪、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和通过测序对转录组和表位进行细胞索引（CITE-seq），可以定义独特的细胞亚群。这些技术极大地扩展了对细胞类型和状态的理解，为样本或患者的多参数分层提供了新方法，同时确定了临床研究的潜在目标。然而，它们通常需要组织分离，不能为正常组织中的细胞间相互作用和疾病中的改变提供空间背景。尽管最近基于成像或测序的方法以单细胞分辨率探测空间转录组，但原位蛋白质检测绝大多数依赖于抗体。因此，抗体已成为几种新的方法的核心，这些方法允许在蛋白质水平上检测空间细胞组织和组织组成。这些复合成像技术能够对人体组织中感兴趣的淋巴细胞、基质细胞、结构标记的细胞类型进行详细的询问和表征，超出了传统荧光显微镜的光谱限制（通常<5个靶点）。随着蛋白质生物标记物数量的增加（图1a），分析变得越来越复杂。未来的分析将需要产生高质量图像的稳健工作流程和优化挖掘这些数据所需的计算工具。本研究总结了几种基于多重抗体的成像方法，并概述了样品制备、抗体验证和面板构建的策略。然后，讨论成像数据的处理、分析和存储。最后，分享了对该领域未来的展望，强调了这些方法的实用性，并为广泛采用本文讨论的方法提供了实用指南。基于复合抗体的成像方法可根据抗体标记模式和检测模式进行分类，每种方法都有各自的优缺点。鉴于试剂和成像系统的广泛可用性，在这些基于抗体的成像模式中，基于荧光的多路成像是最成熟的（图1b）。通常，由于选定荧光团的光谱重叠，荧光实验仅限于在单个成像周期内可视化抗原。超光谱方法可使数据收集超出这一限制，通过利用具有不同激发和发射光谱的荧光团、先进仪器和能够补偿光谱重叠的方法，实现最多通道的单通道多路成像。甚至可以通过迭代、多步骤过程获得更高维的数据集，包括（图1b）（1）荧光或寡核苷酸条形码抗体的免疫标记，（2）直接图像采集（荧光抗体染色材料），或与标记抗体子集的荧光互补寡核苷酸反应，然后进行图像采集，以及（3）荧光团失活或去除抗体或杂交寡核苷酸探针。这个过程通过在每个周期后去除荧光信号来避免光谱重叠。使用迭代染色、成像和漂白/抗体去除方法，如基于组织的周期性免疫荧光（t-CyCIF）、迭代间接免疫荧光成像（4i）、迭代漂白扩展多重性（IBEX）、多表位配体制图（MELC）和多重免疫荧光（MxIF、细胞潜水），使用带有荧光二级或荧光共轭一级的现成抗体可以在同一组织切片中检测60个以上的靶点。

当选择采用或实施基于多重抗体的工作流程时，建议遵循以下原则：“从目标开始”。样本数量、多路成像是否是工作的核心焦点、可用预算和分析支持是选择组织空间轮廓方法时的关键考虑因素（图2a）。如上所述，每种成像方法都有明显的优点和缺点。因此，有关最终数据要求、可用样本和格式以及现有基础设施的问题必须指导多路成像方法的选择（图2b）。

本文描述的基于多重抗体的成像方法与广泛的组织和样品制备兼容，包括新鲜冷冻（FF）、福尔马林固定或福尔马林固定石蜡包埋（FFPE，图3）。当决定样品制备方法时，应考虑保存组织结构、长期储存条件、表位可及性和易于进行多重组织成像。为此，FFPE工作流比大多数FF方法更好地保留了整体组织结构和细胞形态。此外，由于增强了保存和与室温存储的兼容性，大多数临床组织都以FFPE块的形式存储。然而，FFPE的保存使许多目标表位无法接近，由于福尔马林固定而增加自体荧光，并且经常需要抗原回收。与单一标记物IF/IHC相比，适用于一个表位的抗原提取条件可能与另一个表位不兼容，对不同的分子需要不同的抗原提取方法，这使得多重面板的开发越来越具有挑战性。相比之下，FF组织克服了抗原回收的需要，但需要立即快速冷冻和超低温储存进行最佳组织保存。最后，使用1%多聚甲醛和洗涤剂的组织保存方法已被证明能够保存组织结构，通过溶解红细胞最小化组织自体荧光，并且能够使用大范围抗体进行免疫标记，而无需在各种人类和小鼠组织中检索抗原。在设计成像实验时，一个被忽视的考虑因素是总体成本和时间投资，包括试剂、抗体、培训、面板优化、图像采集和数据分析（图3）。有几个因素导致专家组的时间和成本大幅增加，包括专家组的复杂性（例如抗体数量、样本类型、样本制备步骤）、多个周期内目标表位的稳定性（如适用）、抗体兼容性和统一免疫标记条件下的性能，以及迭代面板设计和调整，以获得最佳结果。此外，识别和获得候选抗体可能需要几天到几周的时间，并且可能还需要使用直接标签修改初级抗体。特别是，对于应用于新组织类型的复杂面板，原位验证可能需要数周甚至数月的时间，其中每个抗体需要首先在实验中进行验证，然后在整个面板内进行性能评估。并非所有抗体克隆都能在所有多路技术中工作，而且每种多路技术都需要样本特异性抗体。基于MS的平台更加昂贵，需要专门的成像仪器和昂贵的标记试剂。除了原材料之外，不同的分析和方法对培训的要求也大不相同，可能会大幅增加成本。基于荧光的方法比基于质谱的方法在面板开发上投入更多的时间，因为这些方法具有周期性。然而，随着多路复用方法的商业化和核心设施的采用，时间、培训和优化成本将最终降低。

许多低倍数IHC和IF方法通过二级抗体（间接检测）利用一级抗体检测来实现信号放大。尽管这些间接标记方法很方便，但由于一级抗体宿主物种和同型之间存在显著重叠，因此通常无法使用这些间接标记方法来获得高度复用的数据集。因此，通常需要用能够检测的官能团修饰一级抗体（图4）。最终，试剂制备策略取决于成本、材料可用性、技术能力、规模和预期的实验设计。抗体标记使用了多种共轭方法，每种方法都有明显的优缺点。标记程度和共轭纯度/均一性等因素可能因方法而异。通常，结合化学以抗体的赖氨酸、半胱氨酸或聚糖残基为目标（图4），尽管还有其他定点方法以抗体的氨基末端、定义的赖氨酸基团或片段结晶（Fc）区域为目标。此外，一些非共价方法依赖于二级亲和试剂（例如抗原结合片段（Fab）结构域、纳米体或蛋白质A/G）的预混合进行复用。赖氨酸定向共轭通常优先用于常规染料和寡核苷酸条形码，因为它们快速、经济、可控且可扩展。一个典型的IgG有超过40个暴露于溶剂的赖氨酸，这些残基上的结合程度可以调整抗体与修饰物的比率。虽然可以优化，但标记不是位点特异性的，并且可能导致与非赖氨酸氨基酸残基的异质结合和交叉反应。如果关键赖氨酸位于抗体活性部位，则修饰可降低表位结合活性。这些因素会使探针标准化和验证更加困难，尽管最近的出版物描述了位点特异性赖氨酸修饰，这可能会解决其中一些问题。另外，半胱氨酸定向结合也具有快速、成本效益高、可扩展性强的特点，最好添加金属标签和寡核苷酸条形码。虽然基于半胱氨酸的结合已被证明能产生更均匀和可重复的结果，但在典型的IgG上只有12个可用的半胱氨酸位点。除了较低程度的标记外，半胱氨酸残基的接近可能导致染料彼此共轭，这往往会由于猝灭而降低荧光。此外，在与马来酰亚胺荧光团/螯合剂或交联剂接合之前，抗体必须用tris还原，这可能会影响抗体结构和亲和力。通常，当其他方案失败时，小规模接合或者当结合寡核苷酸条形码时首选聚糖导向方法。IgG在重链上包含两个聚糖位点。正因为如此，聚糖定向结合是位点特异性的，需要较少的抗体-修饰物比率优化，更具重现性，并避免结合位点失活。不幸的是，该方案通常较长，需要酶促反应，成本更高且难以扩展。标准商用抗体制剂可能无法直接与共轭化学兼容，因为它们通常包含叠氮化钠、牛血清白蛋白（BSA）、甘油或冷冻保护剂。为了促进结合，建议购买简单缓冲液（如PBS）中的抗体或进行亲和纯化。此外，储存应保存在PBS或硼酸盐缓冲盐水中。由于每次接合都会导致抗体丢失，建议从50–100µg纯化抗体开始，以产生可观数量的产物。尽管接合程序和方法有很大差异，但本文直观地总结了常见的方法（图4）。最终，定制抗体试剂的生成和验证是开发基于抗体的多功能成像面板的主要瓶颈。与单一复合物相比，与复合物实验相关的共轭抗体的扩展实验计划和验证增加了成本和工作量。定制接合还引入了额外的批次间变化，特别是对于学术研究小组中进行的小规模制备。虽然商业定制结合服务和现成的结合试剂盒使为定制面板修改抗体变得更容易，但更广泛选择与标准染料、金属和寡核苷酸条形码库结合的现成初级抗体将促进其更广泛的采纳。此外，抗体性能经常受到金属标签、荧光团或与之结合的寡核苷酸条形码的选择的影响。因此，针对低丰度表位的抗体应与不与天然自体荧光重叠的明亮荧光团结合。类似地，优选先前针对组织类型验证过的金属基团和寡核苷酸序列组合。定制结合后，应通过与未结合版本进行比较来确认最终抗体-结合物的功能性，并使用目标分析重新评估（图4）。修饰抗体也可能需要改变组织阻断和抗体培养条件以获得最佳性能。

本文作者概述了基于多重抗体的成像，整理了关键资源，并概述了规划和执行多重蛋白质检测实验的注意事项，这些实验可以提供创建真实细胞和组织图谱所需的高分辨率空间背景。此外，这些方法为细胞间相互作用、信号事件、蛋白质的亚细胞定位或翻译修饰提供了直接的见解，并且可以补充游离组织的其他批量分析或单细胞组学分析。通过遵循本文和引用的资源中提出的建议，旨在使其他研究人员能够使用最先进的多路复用方法获得高质量的成像数据。作者相信，这将促进对生物医学研究的发展，并且这些新发现将对科学界产生重大影响。

教授介绍

Sinem Saka就职于欧洲分子生物学实验室，专注于开发分子工具和方法，以增加从实验中获得的数据密度和信息深度。她的研究将成像与单细胞分析的多种互补技术相结合，希望了解细胞状态的表型表现，以及生物学中的空间特征如何影响亚细胞结构、细胞和组织的功能。希望比以前更全面、更无偏见地捕捉单个细胞的终态（通过整合内部和外部因素而达到），以便能够跟踪它们在疾病或压力条件下或在治疗干预反应中的变化，并确定驱动这些变化的成分。通过这种方式，可以发现细胞功能和功能障碍背后的未知谜团。

 

参考文献

Hickey JW, Neumann EK, Radtke AJ, et al. Spatial mapping of proteincomposition and tissue organization: a primer for multiplexed antibody-basedimaging. Nat Methods. 2021;10.1038/s41592-021-01316-y.doi:10.1038/s41592-021-01316-y