质粒载体相关知识

复制子

DNA复制起点

不论细胞中只含有一条染色体(原核生物)还是有多条染色体，细胞每次分裂时每一条染色体都要精确地复制一次，也就是构成染色体的DNA分子要复制一次。复制时，双链DNA分子的每一条单链成为新生成的DNA单链的模板链，即新合成的DNA双链分子中，一条单链是原来的亲链，另一条单链是新合成的子’链，这就是DNA的半保留复制。发生复制的单个DNA单元称为复制子(repli—con)。每个复制子在每次细胞分裂期间只发动一次复制事件。复制子有控制启动复制的元件，称为复制起点(origin of replication)，有的还有一个复制终点(termi—lus)。

原核细胞染色体只有一个复制子，在一个复制起点上启动复制整条染色体。细菌细胞里的质粒也有自己的复制子，有的受控于细菌细胞而同细菌染色体同步复制，这种质粒称为严紧型质粒；有的则独立于细菌细胞而自主地进行复制，称为松弛型质粒。真核生物染色体上有许多个复制子，每一复制子的复制速率低于原核生物。表4—1列出有关复制子的一些基本数据。从酵母中最早分离出真核生物染色体复制子中启动DNA复制的序列，称为自主复制序列(autonomouslyrepli—cating sequence，ARS)。以后在其他真核生物染色体中也确证有ARS。ARS有一个A．T富集区，这个区域内有若干个位点，当这些位点发生突变时会影响到复制起始的功能。对ARS作系统的比较分析后发现，当在一个14 bp的“核心”区中缺 失了由11个A·T碱基对组成的一致序列后，复制起始功能就完全消失。这个一致序列是所有已知的ARS的惟一的同源序列。原核生物和真核生物染色体复制子的复制起点都是一种静止的结构，但线粒体的复制起点则是另一种类型。它（表4-1）不同于染色体DNA分开成两股单链后，双向进行DNA合成，而是以环状DNA双链中的一条单链作为模板(哺乳动物线粒体DNA中称为重链——H链)，启动DNA新链的合成，这样只合成很短一段DNA代替了原来的另一条DNA单链(轻链——L链)中的一段。这一段L链仍保持单链状态，从而形成D环突(D-loop，displacement loop)。哺乳动物线粒体的D—环突约有500～600个碱基，保持D—环突的短链DNA是不稳定的，常被降解和重新合成(图4—2)。有些线粒体DNA 有几个D—环突，说明它有几个复制起点。叶绿体DNA的复制起点的结构同线粒体一样，高等植物叶绿体中有2个D—环突。

质粒的复制子决定其拷贝数

复制子是一个遗传单位，包括DNA 复制起点及其相关的调控元件。在质粒中，复制起点是一段特定的DNA片段，长约几百碱基对，其相关的顺式作用调控元件中含有参与DNA合成起始的由质粒或 宿主编码的可扩散因子的结合位点。因此，质粒复制子可被定义为质粒DNA中能自主复制并维持正常拷贝数的一段最小的核酸序列单位。
在质粒中已鉴定的复制子已逾30个。但是，目前在分子克隆中常规使用的几乎所有的质粒都带有一个来源于pMB1的复制子，该质粒最初是从一例临床标本中 分离到的（Hershfield et al. 1974）。带有该复制子[或有亲缘关系与之十分接近的大肠杆菌E1（colE1）复制子（Balbas et al. 1986）的质粒在每个细菌细胞中可维持15~20个拷贝。然而多年来，pMB1/colE1复制子已经被大量改造以增加拷贝数，从而提高质粒DNA的产 量。高拷贝数的质粒载体广泛应用于分子克隆及几乎所有小片段重组DNA（<15kb）的常规操作中。相反，带有非pMB1/colE1来源的复制子 （见下表）的低拷贝载体则用于某些特定目的，其中包括：①不稳定的DNA序列的克隆及在高拷贝数质粒增殖时具有致死效应的基因的克隆；②构建细菌人工染色 体（BAC），即用于以大肠杆菌质粒的形式扩增大片段（~100kb）外源DNA的载体。

质粒复制的严谨型和松弛型

质粒拷贝数是指在正常生长条件下，每个细菌细胞或每条染色体所对应的平均质粒数。在质粒复制子的调控下，质粒拷贝数可随细菌培养条件的变化在一个较窄的范围内波动。生长条件恒定时，质粒增殖的速度与宿主细胞增殖的速度完全一致，拷贝数保持不变。
无论是质粒，还是其复制子，均能通过合理分配提供影响质粒DNA合成起始频率的分子而维持其自身的复制与宿主增殖率的协调。在携带pMB1/colE1 复制子的质粒中，这种正向调节分子是一种RNA，被称为RNAⅡ，它被用作引发DNA前导链的起始合成。但是，其复制子（如pSC101）的调节分子则是 一种顺式作用蛋白（RepA），它对复制的起始具有正向作用，而对其自身基因的转录具有负调控作用（Linder et al. 1985；综述见Nordstrom 1990；Nordstrom and Wagner 1994；Helinski et al. 1996）。在任何情况下，正向调控的RNA和蛋白质分子的合成和活性都受到辅助性的反式作用产物的调节，后者的浓度随质粒拷贝数或宿主菌的生理状态的变 化而变化。
以RNA分子为其正向调控分子的质粒通常具有高拷贝数，其复制不需任何质粒编码的蛋白质。相反，他们完全依赖于宿主提供的寿命较长的酶和蛋白质，包括分 子伴侣、DNA聚合酶Ⅰ和Ⅲ、DNA依赖RNA聚合酶、核糖核酸酶H（RNase H）、DNA促旋酶和拓扑异构酶Ⅰ（综述见Helinski et al. 1996）。这些质粒以所谓的“松弛”方式进行复制，即使在蛋白质的合成因氨基酸饥饿（Bazaral and Helinski 1968）或添加抗生素如氯霉素（Clewell and Helinski 1969）而受到抑制时，质粒复制仍不停止。由于蛋白质的合成为宿主DNA每轮合成的起始所必需，而非质粒复制所必需，因此经氯霉素处理的细胞中质粒 DNA的浓度相对于染色体DNA的量会有所增加（Clewell 1972）。经过几个小时的扩增，细胞中可能积累数千拷贝的松弛型质粒，最后质粒DNA可占细胞DNA总量的50%甚至更多。相反地，像pSC101这类 质粒的复制需伴随RepA蛋白的合成，因此一旦细胞蛋白质合成受阻，其拷贝数或产量均不能增加。这样的质粒被称为在“严谨”控制下复制的质粒。