✎ 文章导读
文章标题： Non-terminally exhausted tumor-resident memory HBV-specific T cell responses correlate with relapse-free survival in hepatocellular carcinoma
发表期刊：Immunity /2021-07
样本入组：HCC患者外周血，癌旁组织、肿瘤组织
文章结果：1）肝细胞癌（HCC）浸润T细胞的抗原特异性及其与肿瘤控制的相关性；2）CyTOF&抗原肽四聚体（Tetramer）技术检测到91种抗原特异性CD8+ T细胞亚群，这些细胞亚群以HBV、新生抗原、肿瘤相关抗原为靶标；3）高维免疫剖析发现五种抗原特异性组织驻留记忆T细胞（Trm），其中两种细胞亚群在瘤内和肝内HBV特异性T细胞富集，且表现为PD-1loTOXlo；4）具有肿瘤浸润性HBV特异性CD8+ Trm细胞的患者表现出较长的无复发生存期。
慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染容易发展为肝细胞癌（HCC），并导致较差的免疫检查点封闭治疗效果。目前关于肝细胞癌（HCC）浸润T细胞的抗原特异性与肿瘤控制相关性的研究较少，因此新加坡A*STAR研究所的Evan W. Newell研究团队，联合pMHC四聚体(Tetramer)策略和质谱流式细胞技术（CyTOF）剖析了HCC肿瘤组织中的肿瘤相关特异性T细胞，并鉴定出与患者长期复发存活相关的HBV特异性CD8+ Trm细胞亚群。随后研究人员利用scRNA-seq进一步研究Trm细胞签名标签，发现这些细胞的效应属性同终末端耗竭细胞表型相反。该研究表明非终末耗竭的HBV特异性CD8+ Trm细胞显示出主动参与和有效抗肿瘤反应的特征，标志着这些细胞可以被用于治疗。
CyTOF&Tetramer技术研究肿瘤浸润T细胞的抗原特异性
为了评估HCC中抗原特异性CD8 + T细胞的免疫应答，研究人员对46名HCC患者（其中30名感染了HBV病毒）的外周血（PBMC）、癌旁组织（HM）以及肿瘤组织进行pMHC四聚体染色，并联合利用质谱流式细胞技术（CyTOF），筛选了1169种衍生自TA、HBV以及其他病毒（CMV、EBV、IAV）的T细胞表位的抗原。研究人员检测到91种不同的抗原特异性CD8+T细胞群，这些细胞亚群以乙型肝炎病毒（HBV）、新抗原、肿瘤相关抗原为靶标（Fig 1. B-C）。
Fig 1. HBV相关HCC中对病毒和肿瘤衍生的T细胞表位的识别
肿瘤浸润HBV特异性CD8+ T细胞与肝细胞癌无复发生存有关
研究人员对HBV的HCC患者的肝脏及肿瘤组织进行研究，并结合肿瘤复发结果以进一步研究CD69+ HBV特异性CD8+ T细胞能否预测患者的肿瘤复发。研究发现，与肿瘤复发患者相比，无复发患者中可识别HBV特异性抗原表位及CD69 + HBV特异性CD8 + T细胞的相对占比更高（Fig 2.A-B）。那这是否与非复发患者的复发率存在关系呢？随后研究人员基于CD69+特异性CD8+ T细胞的表达，将受试者分为HCC浸润（只在HCC组织中表达），HCC排除（只在HM不在HCC组织中表达），HCC耗竭（在HM及HCC组织中都不表达）三组。其中，HCC浸润患者具有更低的肿瘤复发率，且HCC浸润复发患者HCC及HM中CD69 + HBV特异性CD8 + T细胞占比较低（Fig 2. C-D）。此外，与TA和旁路表位特异性CD8+T细胞相比，HBV 特异性 CD103+CD8+ T 细胞亚群占比增多（Fig 2. E）。这些数据表明，HCC特异性CD8 + T细胞的浸润及CD69和CD103的共表达与患者复发存活有关。
Fig.2 HCC浸润CD103 + CD69 + HBV特异性CD8 + T细胞应答与无患者复发存活相关联
局部炎症和肿瘤组织浸润旁路表位特异性CD8+T细胞
随后研究人员分析了HBV感染与抗原特异性CD8+ T细胞的关系。研究发现较之HBVneg患者， HBVpos患者的HCC以及HM组织特异性CD8+细胞占比较高（Fig 3. A-B)，且组织中的CD69+抗原特异性CD8+T细胞表达占比较高 ，并特异性靶向HBV或TA表位抗原（Fig 3. C）。进一步研究发现在可检测到 HBV 或 TA 病毒特异性 CD8+ T细胞的 HCC 样本中，CD69+ 旁路表位特异性 CD8+ T 细胞具有更高的 IL-7Ra (CD127) 和 CXCR3 表达，同时 CD57 和KLRG-1 水平降低 ，表明这些细胞可能倾向于招募长期记忆而不是终末分化的免疫细胞（Fig 3. D）。此外，研究发现与无复发患者相比，复发患者肝脏能够表达更高水平的旁路CD8+ T细胞（Fig 3. E）。这些数据表明，肿瘤靶向HBV和TA特异性CD8 + T细胞可能会招募旁路表位特异性CD8 + T细胞到肿瘤或炎症等病变位置。
Fig.3 HCC浸润CD103 + CD69 + HBV特异性CD8 + T细胞应答与无患者复发存活相关联
CyTOF进一步研究发现患者肝脏中有5个不同抗原特异性Trm细胞亚群
随后研究人员利用CyTOF，高维剖析了HCC或HM组织中CD69+ T细胞异质性。研究发现了五个高表达PD-1的不同的抗原特异性组织驻留记忆T（Trm）细胞群，这些细胞还高表达TIGIT、2B4以及CCR5（Fig 4 . A-B）。随后对总CD8+ T细胞以及抗原特异性CD8+ T细胞亚群分析研究发现，瘤内和肝内C9 (CD103-CD57 + Trm细胞和C16 (CD103-CD57-Trm)亚群能够识别所有检测抗原。此外，瘤内和肝内HBV特异性CD8+ T细胞选择性富集了C8（CD103 + CD57 + Trm细胞）和C10（CD103 + CD57- Trm细胞）两个Trm细胞亚群（Fig 4. C-D）。
Fig.4 高维免疫剖析确定了五种抗原特异性Trm细胞亚群
单细胞转录组分析表明，肿瘤内和肝内HBV特异性CD8 + T细胞表达功能性TRM相关基因，缺乏末端TEX基因特征
随后研究人员利用Smart-seq2对鉴定的抗原特异性T细胞进一步分析，基于差异基因表达，将细胞分为了8个不同的亚群。其中亚群6和8表达与T细胞效应、激活、归巢以及代谢相关的多种基因（Fig 5. A-B）。此外，研究发现亚群6和8中的大部分细胞属于PD-1+TIM-3-细胞亚群，而只有一小部分的细胞共同表达末端Tex细胞的细胞标志物（PD-1hiTIM-3+）(Fig 5. C)。肝内及瘤内大部分亚群6和8细胞能够识别HBVcore117-, HBVcore101-以及 HBVpoly756v1-。此外，这两种HBV特异性CD8 + T细胞在HCC和HM上具有不同的CD103和CD69的表达（Fig 5. D-E）。对亚群６和８的Tex相关转录特征研究发现，Tox和Eomes的mRNA表达低其他亚群细胞，且较之细胞亚群８，亚群6中的HBV特异性CD8 + T细胞表达较高水平的细胞因子，趋化因子和活化基因，较低的CD57表达水平。对这两个亚群的不同功能免疫途径分析发现，其富集包括TCR（NFAT和PKCQ）和共刺激信号传导，促炎（1型糖尿病和全身狼疮红斑）以及与肿瘤杀灭相关的途径，表明这些细胞在抗肿瘤中活跃。
Fig.５ scRNA-seq显示HBV特异性CD8+T细胞的不同转录组特征
HBVcore-和HBVpoly-特异性CD8 + T细胞显示出显著的克隆扩展并具有独特的TCR克隆表型
最后研究人员利用TraCer技术对274个αβ-TCR克隆进行追踪。研究发现同CD8+ T细胞相比，除了HBVsurf95特异性T细胞，大多数的抗原特异性细胞具有扩增性（Fig 7. B）。且具有相同特异性抗原原性的细胞的TCR通常位于相邻区域（Fig 7. A-C）。值得注意的是，HCC以及HM组织中，HBVcore117-，HBVcore101-，HBVpoly756V1-特异识别的克隆最多。此外，研究还发现大多数的HBV特异性TCR克隆集中于亚群６和８的功能性Trm细胞中（Fig 7. D ）。因此，通过特异性的TCR克隆和转录组谱研究，研究人员鉴定了产生功能性HBV特异性Trm细胞的TCR克隆，并揭示了HBV相关的HCC肿瘤浸润的TCR克隆。
Fig.６ 肿瘤内和肝内HBV特异性CD8+T细胞具有独特的克隆性扩增TCR
文章总结
在该研究中，研究人员直接检测识别了以HBV，TA，NeoAg和常见的病毒为靶标的９1种抗原特异性T细胞亚群。通过高维剖析研究确定了肝脏中的五种不同的抗原特异性Trm亚群，并鉴定出与患者长期复发存活相关的HBV特异性CD8+ Trm细胞亚群。这些Trm细胞特征表明这些细胞的效应属性同终末端耗竭细胞表型相反。该研究为癌症免疫疗法研究提供了重要参考。该研究还表明通过增强肝内HBV特异性Trm细胞反应的疫苗或过继性细胞转移疗法有助于防止肿瘤切除术后复发。
【参考文献】
Hutton C, Heider F, Blanco-Gomez A, et al. Single-cell analysis defines a pancreatic fibroblast lineage that supports anti-tumor immunity. Cancer Cell. 2021.