质谱流式细胞技术（mass cytometry，MC）就是将电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）应用到单个细胞的分析，原理是用纯化的单元素同位素标记抗体，然后使用ICP-MS检测该元素离子峰。该技术融合了流式细胞分选仪和ICP-MS。操作流程简单，如图1所示，首先细胞用带有金属元素（一般是镧系金属）的特异性抗体标记3-4，然后被送入质谱流式细胞仪，细胞以单个细胞液滴状态被雾化后进入高温等离子体，产生自由原子，四级杆选择只通过镧系金属质量范围内的离子，去除其余离子，利用飞行时间质谱（TOF mass spectrometry）检测镧系金属离子的相对信号强度。质谱流式细胞仪由多伦多大学的研究人员首先研发出来，第一台商品化的质谱流式细胞仪名为Cytometry by Time-Of-Flight (CyTOF)，相关抗体试剂由DVS Sciences公司生产和销售。
传统流式细胞术用荧光基团作为报告分子，通过对发射光强度定量以确定目标分子的表达量，但荧光基团发射谱常有重合，尤其是在同一个实验中进行多参数测量的情况下，难以区分多个荧光基团。质谱流式细胞技术使用单一分子量的稳定镧系金属代替荧光基团作为报告分子，元素质谱分析仪能够通过分子量准确区分不同原子质量，并且不同镧系金属质量没有信号重叠，增加了定量的准确性。
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目前，质谱流式细胞技术可以同时对51个靶蛋白进行检测，每秒检测1000个细胞，平均每天可检测100个样品，最低检测限为100个拷贝分子，已经过验证的镧系金属标记抗体种类超过400种；除常规蛋白外，质谱流式细胞技术还可用于蛋白翻译后修饰1，蛋白降解产物5，检测细胞存活率，细胞大小，mRNA转录子表达量6，DNA合成速率7以及蛋白酶活性8等的测定。
多路质谱流式细胞技术
正如蛋白质组学中的非标记定量，质谱流式细胞技术对靶点的定量准确性也受到不同仪器离子化效率的差异、仪器状态等的影响；同时，传统的质谱流式细胞技术每次只能检测一个样品，通量较低。因此，质量标签细胞条码技术（mass-tag cellular barcoding，MCB）应运而生。
细胞经过药物等处理后，用多聚甲醛固定后，使用MCB试剂对不同样本的细胞进行条形码标记，然后将不同样本混合后进行常规质谱流式细胞分析前处理和检测。最终通过检测条形码对应的元素离子，对细胞进行样品归类。
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图2. 多路质谱流式细胞技术
多路质谱流式细胞技术实验步骤如图2所示，不同处理的样本经过甲醛固定，使用不同mDOTA分子对不同样本进行标记，然后进行常规的质谱流式细胞分析的前处理和检测。
这里使用的mDOTA分子是一个双功能化合物，一端可以螯合金属离子，一端则可以和细胞中蛋白上的自由巯基以共价键形式结合（如图3所示），一个mDOTA分子可以螯合一个镧系金属元素原子，那为什么叫barcode呢？ Barcode 就是指可以同时添加多种被镧系金属元素螯合的mDOTA分子，在CyTOF中共价键被打碎后，每种镧系金属元素的峰即可形成有和无两种情况，使用的镧系金属元素螯合的mDOTA试剂的种类越多，最终可组成的条形码种类越多，如图4所示，使用7种镧系金属元素螯合mDOTA试剂，可以组成2的7次方种条形码，即可以同时标记128个样品。 MCB的使用，可以对多个样本同时进行单细胞定量分析，增加了质谱流式细胞分析技术的分析通量，并且增加了相对定量的准确性。 本文一开始提到的那篇Cell Stem Cell的文章，就是利用MCB技术，在单细胞层面研究人源红细胞生成过程中内源转录因子的表达和调控。
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图3. mDOTA分子反应原理
细胞使用双功能分子mDOTA（maleimido-mono-amide- DOTA）以共价键形式进行标记。mDOTA一端可以螯合稀土元素，一端可以和细胞内的蛋白的巯基反应。
但是MCB存在一定的缺陷，首先在每次仪器校正后，质谱流式细胞仪的离子检测灵敏度都会发生变化，尽管可以用内参进行校正，将样品混合后检测会降低样品之间的变化程度； 其次，MCB使用镧系金属元素和后期使用的抗体耦连的镧系金属不能相同，因此MCB的使用缩小了后续标记抗体的选择范围。 因此，后来基于钯元素的MCB试剂被进一步发展出来11。 使用钯元素的6个同位素原子进行MCB分子的构建有以下两点优势： 首先，钯元素因为和标记抗体的试剂（Diethylene triamine pentaacetic acid (DTPA)-based polymer）不兼容，抗体标记不会使用钯元素，因此MCB分子使用钯元素不会干扰后续标记抗体的选择； 第二，Pd有6个稳定同位素，102, 104, 105, 106, 108和110 amu, 纯度很高，分别为91%, 96%, 98%, 99%, 99%和99%，这些同位素和其他镧系金属元素质量相差甚远，不会影响后续的抗体耦连的镧系金属元素的检测。
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图4. MCB形成原理
使用七种镧系金属元素螯合mDOTA试剂，按图中分布添加mDOTA试剂，可以组成2的7次方种条形码，即可以同时标记128个样品。
质谱流式细胞技术的优缺点
最后我们简单说一下这个技术的优缺点。优点是可同时检测的通道比较多，现在可以做到同时检测51个目标蛋白；可操作性强，试剂都是商品化的；速度虽然比不上流式细胞仪（每秒10000个细胞），但也并不慢，每秒可检测1000个细胞；成本低，平均每个细胞测量成本仅需0.005美分，对比单细胞测序技术每个细胞平均22美元，可以说是相当便宜了。
当然，就目前来看，这个技术还存在不少的不足之处。 首先，细胞在分析中被雾化并离子化，在分析后不能保留完整的活细胞状态； 其次，灵敏度低于荧光基团，不能检测极低水平表达的分子，检测的动态范围最多只能达到3-4倍，而荧光基团的检测范围则可到50倍左右；第三，不同仪器之间的离子化效率不同，需要通过掺入聚苯乙烯珠子进行信号强度的校正，实现同一个仪器的数据的比较； 第四，和基于荧光基团的流式细胞技术一样，质谱流式细胞技术仍然不能检测小分子代谢产物，并且不能对一个细胞进行连续的动态监测； 最后，也是最重要的一点，不能对蛋白组中的所有蛋白进行监测，只能对特定目标蛋白进行检测，因此需要更为严谨的实验设计。
不管怎样，质谱流式细胞技术还在不断地发展和改进，我们能利用这个技术解决的问题也越来越多。希望通过这次对质谱流式细胞技术的系统性介绍，也能为大家目前面临的问题提供一点新思路，为大家的课题添砖加瓦。（来源清华大学蛋白质研究技术中心蛋白质化学与组学平台）
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