三、白鹤亮翅
稍右转体 跟步抱球 后坐转体 虚步分手
与单细胞数据集成
在〜50um时，来自于病毒测定的斑点将涵盖多个细胞的表达谱。对于可获得scRNA-seq数据的系统列表不断增加，用户可能有兴趣对每个空间体素进行“反卷积”以预测细胞类型的潜在组成。在准备此小插图时，我们使用了参考scRNA-seq数据集测试了多种decovonlution和整合方法使用SMART-Seq2协议生成的来自Allen Institute的约14,000个成年小鼠皮质细胞分类学。我们一直发现使用积分方法（而不是反卷积方法）具有更好的性能，这可能是由于表征空间和单细胞数据集的噪声模型存在很大差异，并且积分方法专门设计为对这些差异具有鲁棒性。因此，我们应用了Seurat v3中引入的基于“锚”的集成工作流，该工作流使注释能够从引用到查询集的概率传输。因此，我们利用sctransform归一化方法遵循此处介绍的标签传输工作流程，但期望开发出新方法来完成此任务。
我们首先加载数据（可在此处下载），对scRNA-seq参考进行预处理，然后执行标签转移。该过程为每个点输出每个scRNA-seq派生类的概率分类。我们将这些预测添加为Seurat对象中的一项新分析。
allen_reference <- readRDS("../data/allen_cortex.rds")
# note that setting ncells=3000 normalizes the full dataset but learns noise models on 3k cells
# this speeds up SCTransform dramatically with no loss in performance
library(dplyr)
allen_reference <- SCTransform(allen_reference, ncells = 3000, verbose = FALSE) %>% RunPCA(verbose = FALSE) %>%
RunUMAP(dims = 1:30)
# After subsetting, we renormalize cortex
cortex <- SCTransform(cortex, assay = "Spatial", verbose = FALSE) %>% RunPCA(verbose = FALSE)
# the annotation is stored in the 'subclass' column of object metadata
DimPlot(allen_reference, group.by = "subclass", label = TRUE)
image
anchors <- FindTransferAnchors(reference = allen_reference, query = cortex, normalization.method = "SCT")
predictions.assay <- TransferData(anchorset = anchors, refdata = allen_reference$subclass, prediction.assay = TRUE,
weight.reduction = cortex[["pca"]], dims = 1:30)
cortex[["predictions"]] <- predictions.assay
现在，我们获得了每个班级每个地点的预测分数。在额叶皮层区域中特别令人感兴趣的是层状兴奋性神经元。在这里，我们可以区分这些神经元亚型的不同顺序层，例如：
DefaultAssay(cortex) <- "predictions"
SpatialFeaturePlot(cortex, features = c("L2/3 IT", "L4"), pt.size.factor = 1.6, ncol = 2, crop = TRUE)
image.png
基于这些预测分数，我们还可以预测位置受空间限制的单元格类型。我们使用基于标记点过程的相同方法来定义空间可变特征，但将细胞类型预测得分用作“标记”而不是基因表达。
cortex <- FindSpatiallyVariableFeatures(cortex, assay = "predictions", selection.method = "markvariogram",
features = rownames(cortex), r.metric = 5, slot = "data")
top.clusters <- head(SpatiallyVariableFeatures(cortex), 4)
SpatialPlot(object = cortex, features = top.clusters, ncol = 2)
image.png
最后，我们证明我们的整合程序能够恢复神经元和非神经元子集（包括层状兴奋性，第1层星形胶质细胞和皮质灰质）的已知空间定位模式。
SpatialFeaturePlot(cortex, features = c("Astro", "L2/3 IT", "L4", "L5 PT", "L5 IT", "L6 CT", "L6 IT",
"L6b", "Oligo"), pt.size.factor = 1, ncol = 2, crop = FALSE, alpha = c(0.1, 1))
image.png