A geminivirus-relatedDNA mycovirus that confers hypovirulence to a plant pathogenic fungus(Yu et al., 2010)
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简介
在这个研究之前，已知真菌病毒的遗传物质多为dsRNA或者ssRNA，还没有DNA病毒的报道。这个文章在核盘菌（Sclerotinia sclerotiorum）中发现了遗传物质是环状DNA的真菌病毒，命名为Sclerotinia sclerotiorum hypovirulence-associated DNA virus 1(SsHADV-1)，该病毒基因组为2166nt，编码复制起始蛋白（Rep）和衣壳蛋白（CP）。尽管对Rep的系统发育分析指出SsHADV-1与geminiviruses病毒亲缘关系较近，但是它们的基因组其他部分以及病毒粒子的形态都有很大不同。聚乙二醇介导的真菌原生质体转化无论采用纯化的病毒粒子还是DNA都很成功，实验发现这种geminivirus相关病毒SsHADV-1的转入会产生弱毒菌株，可能用于生物防治。
实验材料
在发病材料上分离的核盘菌DT-8，以及通过hyphal tipping或protoplast regeneration得到的virus-free菌株DT-8VF。
实验室原有的弱毒核盘菌Ep-1PN（有两个RNA病毒），以及通过single-ascospore-isolationprogeny得到的正常脱毒菌株Ep-1PNA367。
这两对真菌形态，致病力，菌核大小，生长速率等的对比可见病毒对它们的影响还是蛮大的。通过hyphaltipping或protoplast regeneration脱毒的DT-8VF表现了更强的致病力和活力，而且在它与原始DT-8菌丝融合后，有重新获得了弱毒菌株的特性，这是很明显的病毒介导的真菌弱毒的表现。
核酸提取和DT-8中的DNA元素
提取了DNA，总RNA（使用前用DNaseⅠ处理）。杂交实验是指Southern和Northernblot。
经验主义告诉作者，一般都是RNA病毒，然而用DT-8菌丝提取dsRNA却总是不成功，于是他们只好提取DNA（这让我想起来我的proli小菌也是这种情况，想把我之前提取的DNA用RNA酶处理顺便浓缩一下，再跑胶看一看，还可以单孢子菌丝切尖端看一看会不会脱毒）。
并且跑了胶，有趣的是DT-8的DNA电泳图比DT-8VF多了两个条带，大小在2kb（LargeDNA element，LDE）和0.3kb（small DNA element，SDE）。这两个条带可以被DNase I(active against ssDNA and dsDNA) 和 S1nuclease (active against ssDNA or ssRNA)降解，但是不能被Exonuclease III (active against linear dsDNA) 和Exonuclease I (active against linear ssDNA)降解，所以它是circular ssDNA 或者 linear ssDNA with modified 5′ and 3′ends。
DNA病毒基因组
首先为了获得全序列的一部分，先用random primers扩增，然后根据已知部分序列通过inverse-PCR（【现学现卖】实验-PCR）得到全长。测序，系统发育分析。序列分析装配用的是DNAMAN version 5.2.9。比对相似度，蛋白motifs在NCBI网站完成。结果显示包含两个ORFs，一个编码CP，另一个编码Rep，Rep有两个保守结构域，分别是geminivirus Rep catalytic domain (Gemini_AL1) 和geminivirus Rep protein central domain (Gemini_AL1_M)，在rolling-circle replication中起作用。有两个intergenicregions将两个ORF分开，大一点的（Largeintergenic region, LIR）有133nt，小一点的（small intergenic region，SIR）有119nt。LIR和SIR和Geminiviridae家族的Mastrevirus很相似。LIR上的小啾啾可以在病毒DNA复制的起始被Rep识别。
研究还发现SDE（就是300bp那个表带）包含了多种ssDNA分子，236-284bp长，是LDE中的缺陷DNA（我的poae也有很多这样的条带。300-500bp左右），它们没有ORFs，但是有LIR和SIR（会不会是侵染或者复制的副产物？我要快看看那几个小条带是哪个大病毒上的）。
分析了Rep，CP的氨基酸序列，构建系统发育树。
病毒粒子
为了证明LDE就是病毒的基因组，作者培养了大量菌丝，梯度蔗糖法分离病毒粒子（我的实验里这个没能做，是因为梯度法没能分离开病毒粒子们，poae里面有太多的共侵染了，下次换个没有2000bp条带且条带少的菌，也许可以做）。将得到的粒子用电镜观察，做SDS/PAGE并N端测序，从粒子中提取DNA再利用特异性引物PCR验证，还可以用病毒粒子做侵染实验（这里用了另一种方法（文献46，针对geminivirus的方法，也可以参考一下），不是蔗糖梯度，因为蔗糖得到的病毒粒子侵染性会下降）。
最后发现，提取的DNA和蛋白的大小和预测的一样，N端测序分析指出分离的蛋白是病毒衣壳蛋白。综上，DT-8的DNA电泳图里面LDE条带确实是环状ssDNA病毒(SsHADV-1)的基因组。
侵染转化实验
制备真菌原生质体（在文献40，42的基础上稍加改进），侵染的材料则是上面提取的病毒粒子和从感染的真菌菌丝经过MillexR GP filter units (Millipore)过滤物质中直接提取的DNA。采用PEG介导转化的方法（文献47-49并稍加改进），转化后进行菌落形态，PCR等鉴定。
讨论
也许真菌病毒有其特殊的进化方式。这个真菌病毒和植物病毒相似度高，但是很多地方却有不同。鉴于geminivirus-based vectors是研究植物基因组的工具，SsHADV-1也可能发展为研究真菌基因组的工具。SsHADV-1也有很强扩散能力和衰弱真菌的能力，作者期待它的寄主范围更大，并成为生防病毒。
Yu, X., Li, B., Fu, Y., Jiang,D., Ghabrial, S.A., Li, G. et al. (2010) A geminivirus-related DNA mycovirusthat confers hypovirulence to a plant pathogenic fungus. Proceedings of the National Academy of Sciences 107: 8387-8392.