Cell |合成细胞通讯系统，可控制细胞密度
原创 旧岛望月亮 图灵基因
收录于话题#前沿分子生物学技术
撰文：旧岛望月亮
IF=41.582
推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐
亮点：
1.作者利用基因工程技术设计了人工合成的细胞通讯系统。
2.在该研究的基础上，未来可以进一步设计更为复杂的系统用于协调控制多种类型的细胞。
细胞增殖作为生物体的重要生命特征，是生物生长、发育、繁殖以及遗传的基础。多细胞生物可以通过细胞分裂的方式产生新细胞，用于替换体内衰老或死亡的细胞。除此之外，细胞还可以通过细胞间的通讯系统，主动感知和控制种群密度。2022年3月1日加州理工学院Michael B.Elowitz等人利用基因工程技术设计了人工合成的细胞通讯系统，旨在揭示控制种群密度的原理以及改进现有的细胞疗法。其研究结果发表在名为”Synthetic mammalian signaling circuits for robust cell population control”的文章中。
图1a展示了作者设计细胞通讯系统的基本思路。首先，理想的专用通讯系统要求Sender细胞产生的信号特异性地作用于Receiver细胞的目标蛋白，并且该过程应当确保不会对改造前的宿主细胞产生影响(图1a左)。接着对上述通讯系统进行改进，设计出了Sender-Receiver细胞，它能根据感应到的种群密度做出特定的反应(图1a中)。最后，在此基础上使Sender-Receiver细胞产生的信号抑制细胞增殖，进而控制种群密度(图1a右)。依据上述原理，用于设计改造的细胞信号通路需要满足以下条件：不会与改造前的宿主细胞发生相互作用，能够外部控制信号强度，适用于多种细胞类型，能快速调节不同目标蛋白的活性，具有较低的免疫原性等。生长素*作为一类植物特有的激素，能很好地满足上述要求。
*生长素(auxin)：一类广泛分布于植物体内的激素，能促进植物茎、根、芽的生长。
图1 细胞通讯系统的设计思路
首先，作者利用基因工程技术构建了一个受生长素调控的Receiver细胞(图2b)。在自然条件下，生长素作用于转运抑制响应蛋白1(TIR1)*，促使其与目标蛋白相结合，诱导形成SCF复合物*。后者能招募E2泛素连接酶，降解目标蛋白。然而哺乳动物细胞内并不存在TIR1及其作用靶点，因此生长素不能直接用于降解哺乳动物的内源性蛋白。先前的研究人员利用基因工程将目标蛋白与生长素诱导降解因子(AID)*相连接。后者在生长素(黄圆)存在时，能与水稻中异位表达的TIR1(osTIR1)结合并组装形成SCF复合体，再通过泛素化途径对目标蛋白进行降解。利用上述原理，作者选取BlastR*作为目标蛋白，从而构建了由生长素调控细胞存活的通讯系统。此外，作者还在CHO-K1细胞*的基因上插入了mCherry*，用于标记BlastR蛋白的浓度。免疫荧光结果发现mCherry的荧光强度随IAA*和NAA*两种生长素浓度的增加而减少(图2c)。在含有blasticidin S的培养液中添加IAA能降解BlastR蛋白并抑制细胞存活(图2d)。上述结果表明，通过基因工程设计的Receiver细胞能受到生长素的调控。
*转运抑制响应蛋白1(transport inhibitor response 1, TIR1)：生长素的受体蛋白，属于F-box蛋白质家族。它与生长素相结合，从而介导生长素发挥相应作用。
*SCF复合物((Skp1-Cul1-F-box蛋白复合物)：一类泛素化连接酶，通过泛素化促进蛋白酶体降解，在促使细胞进入增殖周期中发挥重要作用。
*BlastR(blasticidin S deaminase)：blasticidin S——即杀稻瘟菌素S，是一类核苷类抗生素，在低浓度下能导致细胞迅速死亡。其原理是通过干扰核糖体中肽键的形成，特异性抑制原核和真核生物的蛋白质合成。而BlastR为blasticidin S的脱氨酶，其所编码的蛋白质能使细胞在blasticidin S存在的情况下存活。
*CHO-K1细胞：中国仓鼠卵巢细胞亚株。
*mCherry：一种红色荧光蛋白，吸收峰和发射峰分别为587和610nm。由于具有较好的光稳定性，其常用于标记某些细胞和分子。
*IAA(indole-3-acetic acid, 吲哚-3-乙酸)：一种天然的植物生长素。
*NAA(1-napthalenatic acid)：人工合成的生长素类似物
图2 基因工程改造的Receiver细胞感知、响应生长素
已有报道发现吲哚-3-乙酸水解酶，如iaaH、Ax2和AMI1，能将生长素前体IAM和NAM水解成对应的活性形式IAA和NAA(图3a)。因此进一步改造上述Receiver细胞，得到了Sender-Receiver细胞(图3b)。将Sender-Receiver细胞在含有IAM的培养基中培养两天，取该培养液与新的培养基等比混合得到条件培养基，之后用其培养Receiver细胞并观察mCherry的荧光强度(图3c)。结果发现条件培养基具有与生长素IAA和NAA相同的降解作用(图3d，其中相比于NAM，IAM产生的降解效果更好)，说明Sender-Receiver细胞能够有效地将生长素前体转化为生长素，从而调控Receiver细胞的生长。
图3 基因工程改造的Sender-Receiver细胞产生生长素
接着，作者试图研究Sender-Receiver细胞能否产生与种群大小成比例的生长素，进而调控种群密度。在生长素前体IAM和NAM浓度足以产生饱和的生长素的情况下，作者分析了细胞种群密度对BlastR基因表达的影响。由于加入IAM后BlastR基因表达显著降低且不随种群密度变化(图4a)，作者向Sender-Receiver细胞基因中插入生长素转运蛋白PIN2*，控制胞内生长素浓度(图4b)。结果表明Sender-Receiver细胞能在IAM(含PIN2)或NAM存在的情况下，根据种群密度控制BlastR基因表达，从而实现对种群密度的感知。不同容量的培养基中mCherry的荧光强度对细胞密度的反应相似，说明其不受到细胞绝对数量的影响(图4c)。将不同密度的细胞接种在含blasticidin S的培养液中，4天后测试细胞数量。结果发现，IAM在高种群密度下能诱导Sender-Receiver-PIN2细胞死亡(图4d)。
*PIN2：拟芥兰中的一类转运蛋白，介导生长素的外排。
图4 基因工程改造的细胞感知种群密度
在上述研究的基础上，作者考虑了细胞发生基因突变后引起的逃逸反应——即当细胞对生长素不再敏感时，BlastR能使细胞免受blasticidin S的伤害并持续增殖(图5a下)。为了解决这一问题，作者对上述细胞模型加以改造得到了“矛盾”的控制系统Paradaux，其基本思路为同时抑制细胞的增殖和凋亡来维持种群密度。另一方面当细胞发生突变时，该通路能促进细胞凋亡从而消灭逃逸细胞(图5a上)。根据这一思路，作者在先前设计的基础上，在细胞基因内插入了连接AID的iCasp9基因，后者表达的蛋白能在小分子二聚体AP1903的作用下诱导细胞凋亡(图5b)。另外作者还利用mGFP*表征了iCasp9蛋白的浓度。此外，由于该序列中未插入PIN2，所以作者选用生长素前体NAM启动该系统。实验结果表明在blasticidin S或AP1903单独存在的情况下，随NAA的增加细胞存活率分别表现为降低或者增加(图5d红或绿)。利用上述数据计算Paradaux系统的数学模型，并对两条曲线进行拟合，得到了blasticidin S和AP1903同时存在的情况下，细胞存活率的变化趋势(图5d蓝点)。根据数学模型计算出能促使细胞种群密度保持恒定的blasticidin S和AP1903的浓度(图5e)，之后利用计算得到数据研究细胞在实际情况下的种群密度。实验结果表明，与对照组细胞、Sender-Receiver细胞(负反馈组)相比，Paradaux组细胞存活时间延长并且能在更长的时间内保持种群密度的稳定(图5f)。
*mGFP：一种用于标记的绿色荧光蛋白。
图5 “Paradaux”通路控制细胞种群密度恒定
自然条件下，细胞能通过信号通路控制其种群密度。利用该原理，作者在哺乳动物细胞中设计了一种方法产生和响应生长素，并将其与控制细胞增殖和凋亡的基因相联系，从而调控种群密度。作者提出，该通讯系统为设计多种类型细胞间的通讯和控制系统提供了可能性。例如为了记录两类细胞之间的相对距离，人们可以把其中一类细胞设计成Receiver细胞，当其与第二类细胞分泌的生长素相接触时便能被激活。此外，种群感知与控制可以用于改进工程细胞疗法，使细胞在特定的靶标位置被激活。
教授介绍
Michael B. Elowitz为加州理工学院的教授，也是霍华德·休斯医学研究所的研究员。他于1992年获得加州大学伯克利分校学士学位，于1999年获得普林斯顿大学博士学位。Michael B. Elowitz所在课题组的主要研究方向是遗传学和分子生物学。他的团队试图通过生物通讯系统编码细胞行为，其研究成果发表在Science、Nature、PNAS等期刊上。2007年因设计基因调控通路“Repressilator”，获得了麦克阿瑟天才奖。
参考文献
Ma Y, Budde MW, Mayalu MN, et al.Synthetic mammalian signaling circuits for robust cell population control.Cell. 2022; S0092-8674(22)00137-4. doi:10.1016/j.cell.2022.01.026