Cell | 自身免疫炎症期间稳态和致病性细胞的转化
原创 骄阳似我 图灵基因 2021-12-22 07:03
收录于话题#前沿分子生物学机制
撰文：骄阳似我
IF：41.582
推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐
亮点：
1.本文通过在体内稳态和CNS自身免疫炎症期间对84000多个Th17细胞的转录组和TCR克隆型进行命运定位和分析，对组织Th17细胞的异质性、可塑性和迁移表型进行了表征。器官间和器官内单细胞分析揭示了一个稳态的干细胞样TCF1+IL-17+SLAMF6+群体，其通过微生物群运输到肠道，为IL-23驱动的脑炎性GM-CSF+IFN-γ+CXCR6+T细胞的生成提供了一个现成的储库。
2.本文的研究确定了IL-17+非致病性与GM-CSF+和IFN-γ+致病性Th17人群之间的直接体内关系，并提供了一种稳态肠道Th17细胞指导肠外自身免疫疾病的机制。
产生白细胞介素-17（IL-17）的CD4+T细胞（Th17细胞）在多种自身免疫疾病中发挥重要作用。然而，最近的研究表明，IL-17和Th17细胞对自身免疫组织炎症的驱动作用并不关键，而粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）产生的T细胞（ThGM）被认为是自身免疫组织炎症的主要诱导因子。此外，Th17细胞在体内包含高度异质性和可塑性细胞群，产生多种不同的效应和调节性T细胞群。然而，目前尚不清楚组织Th17细胞是如何将这些不同的信号整合到一组细胞程序中的，这些细胞程序使它们能够维持组织内稳态，但却成为组织炎症的主要驱动因素。
近期，在cell杂志上发表了一篇名为“Stem-like intestinal Th17 cells give rise to pathogenic effector T cells during autoimmunity”的文章，将单细胞RNA和TCR测序与命运图研究相结合，以分析84124个组织Th17细胞，并描述其在稳态和中枢神经系统（CNS）自身免疫期间的异质性、可塑性和迁移。组织Th17细胞既表现出组织特异性特征，又表现出组织内异质性。在诱导脑脊髓炎（EAE）后，发现了一个干细胞样的肠道TCF1+SLAMF6+IL-17+细胞群，该细胞群产生第二个致病性GM-CSF+干扰素（IFN）-g+CXCR6+Th17细胞群，该细胞群特异性迁移到中枢神经系统。本文的工作确定了干细胞样肠Th17细胞向致病性Th17细胞的转变，并解释了EAE期间IL-17+与GM-CSF+IFN-γ+致病性T细胞之间的争议，这一概念可能适用于其他自身免疫和炎症性疾病。
使用scRNA/TCR-seq，分析了46351个在发病时从SPL、MLN、PP、COL、SI、EAE免疫部位腹股沟引流淋巴结（DLN）和CNS分离的tdTomato+组织Th17细胞。首先关注中枢神经系统浸润性T细胞。8942个Th17（TD17+）CNS来源的细胞分为五个簇，通过差异基因标记将其注释为静止（簇0）、迁移（簇1）、增殖（簇2）、CD8样（簇3）和促炎（簇4）。这些细胞在低维空间中从静止到迁移排列，然后从迁移细胞分裂成增殖细胞、CD8样细胞和促炎细胞。静止簇0中的细胞高度表达与T细胞静止相关的基因（例如Samhd1、Il7r、Tcf7和Btg1），并且每个细胞检测到的转录物数量最低，支持静止细胞状态。迁移簇1中的细胞高度表达参与细胞迁移（Ltb4r1、Cxcr6、Vasp）和形态学（Tmsb10、Cotl1）的基因，表明这些细胞最近迁移到中枢神经系统。增殖簇2细胞高度表达细胞周期基因（Birc5、Cks1b、Cdk1、Mki67）。CD8样细胞（簇3）表达Cd4和CD8+T细胞标记物（Nkg7、Ccl5、Cd8a）和细胞毒性（Prf1、Gzmk）基因。最值得注意的是，发现了一个高度促炎、活化和扩增的细胞亚群（簇4），在中枢神经系统中富集了当前的Th17细胞。具体而言，促炎簇4中的细胞表达了编码促炎细胞因子的最高水平的基因，并且每个细胞的转录物数量最多。PD-1标记出高度促炎性Th17细胞，其产生高水平的IL-17A、IFN-γ和GM-CSF细胞因子，这些细胞因子与脑炎性相关。图1：功能不同的脑源性Th17细胞亚群的鉴定。
为了研究组织Th17细胞在EAE诱导中的机制和作用，重点研究了外周组织中的Th17细胞，并检测了来自原始和EAE小鼠的所有84124个组织Th17细胞。结果表明组织Th17信号比EAE免疫诱导的表达变化具有更强的鉴别能力。接下来使用EAD小鼠中Th17细胞的TCR序列来了解所有组织中Th17细胞与脑源性Th17群体之间的关系。EAE期间，小鼠之间仅共享少数克隆型，而同一小鼠的组织之间共享5%-35%的克隆型。组织间的TCR库相似性分析发现来自DLN、SPL和CNS的细胞之间具有高度克隆相似性的Th17群体，表明这些克隆型可能是主要的疾病驱动群体，以及肠组织中具有高度克隆相似性的Th17群体（MLN、PP、SI、COL）。最近的研究强调了“肠-脑轴”的作用，其中肠道Th17细胞通过未知机制被建议调节CNS自身免疫性炎症。本文结果提出了一个模型，其中Th17细胞在DLN中被诱导，然后通过SPL进入CNS。以解决肠道Th17细胞的潜在作用在EAE疾病中，将肠道Th17细胞的TCR序列与其他组织Th17细胞进行比较。有趣的是，在脾脏中发现了一小部分Th17细胞，它们与MLN、PP、SI和COL中的肠道相关Th17细胞具有TCR克隆型结构。得出结论，SPL中可能存在两个不同的克隆相关Th17细胞群，一个与DLN和CNS细胞（占SPL细胞的26.2%）共享克隆型，另一个较小的SPL细胞群（占SPL细胞的10.6%）。因此假设SPL可能是一个关键枢纽，作为传播肠道Th17细胞和脑源性Th17细胞的来源。图2：EAE期间组织Th17细胞的单细胞分析。
对EAE期间脾脏Th17细胞异质性的进一步分析表明，大多数细胞（85%）位于两个簇中的一个，类似于稳态非致病性Th17细胞（SPL0）或致病性Th17细胞（SPL1），基于已知基因和特征的表达，致病性样SPL1细胞大量克隆性扩增。在稳态Th17细胞中上调的基因中，既有先前与非致病性Th17细胞（Ccr6、Il6ra、Ikzf3、Maf）相关的基因，也有肿瘤和LCMV感染中描述的干细胞样CD8+T细胞（Tcf7、Cxcr5）中表达的基因。相反，SPL1细胞表达了和其他人以前与致病性Th17细胞相关的高水平基因（Ifng、Tbx21、Bhlhe40、Csf2）。将SLAMF6+和CXCR6+鉴定为两种细胞表面分子，可区分SPL0和SPL1群体，并通过对EAD小鼠脾脏中的SLAMF6+和CXCR6+TdTomatogy+CD4+T细胞进行分类，然后进行大量RNA序列分析，分别验证其作为SPL0和SPL1细胞的标记，表明它们的相关特征分别在SPL0和SPL1细胞中表达。SLAMF6+细胞在体内平衡期间以高比例存在于脾脏中，在EAE中减少，而CXCR6+细胞在EAE疾病期间在脾脏和CNS中显著增加，在脾脏中出现临时峰值，随后在CNS中稳步上升。值得注意的是，SLAMF6+和CXCR6+标记也在DSS诱导的结肠炎小鼠的tdTomato+CD4+T细胞的scRNA-seq图谱中标记了不同的细胞群，这表明对其他炎症条件可能具有更广泛的意义。脾脏SLAMF6+和CXCR6+群体具有不同的染色质可及性景观，具有17449个差异可及区域，支持它们的独立特性。在Slamf6+人群中，参与稳态和干细胞样Th17细胞表型（Il6ra、Ccr7、Ccr6、Slamf6、Tcf7、Cxcr5）的基因座是可特异性访问的，而参与Th17致病性的基因座（Ifngr1、Nkg7、Tbx21、Cxcr6、Bhlhe40、Csf2、Ifng）在Cxcr6+人群中是可特异性访问的。因此，鉴定了两个具有不同表达和染色质可及性特征的脾脏Th17细胞群，它们类似于稳态干细胞样细胞群和致病性Th17细胞群，分别由表面标记物SLAMF6和CXCR6标记。图3：脾脏内稳态和致病性Th17群体的发现。
基于对两个克隆相关Th17细胞群的发现，假设SPL0（稳态）和SPL1（致病）细胞分别代表脾脏中的肠道相关和脑源性Th17细胞群。事实上，在所有组织中，SPL0细胞显示出与Th17细胞相似的TCR序列，而SPL1细胞几乎完全与DLN和CNS中的Th17细胞共享TCR。SPL0细胞高度表达参与免疫细胞在淋巴组织（Cxcr5、Ccr7、Sell）和肠道（Ccr9、Itga4）中迁移和滞留的基因，而SPL1细胞表达参与免疫细胞运输到炎症部位的基因（Ccr5、Itgb1、Crip1、Cxcr6、Ccr2）。稳态和EAE时所有组织簇的TCR相似性分析揭示了克隆型共享的模式。具体而言，在体内平衡时，来自同一组织的细胞簇共享克隆型，表明每个组织内的高克隆性（和可塑性），并且TCR特异性是决定组织Th17细胞归巢和扩增的主要因素。稳态SLAMF6+SPL0细胞与所有组织中的簇具有高度的克隆相似性。值得注意的是，在EAE中，只有SPL0细胞与这两个群体共享大量TCR序列，而SPL1细胞与SPL、DLN和CNS中的所有簇显示出密切的TCR共享。SPL1与所有CNS簇显示出强烈的TCR共享，表明SPL1与CNS中的所有Th17细胞表型相关。值得注意的是，一个小的SI簇（SI5）与疾病驱动生态系统和高度表达的迁移基因分组。为了验证SPL0和SPL1细胞在EAE期间在体内具有不同的迁移行为，将从激活EAE小鼠获得的SLAMF6+和CXCR6+SPL细胞分类并过继转移到具有同源标记的小鼠中，该小鼠在转移前7天免疫EAE并收获转移后7天（EAE免疫后14天）每个组织中的细胞。CXCR6+转移群体仅在CNS、DLN和SPL中发现，而SLAMF6+群体存在于包括肠组织在内的所有组织中，证实了EAE期间SPL0和SPL1在体内的不同迁移特征。基于先前的研究表明肠道Th17细胞可以影响EAE的发展，假设干细胞样的肠道TCF1+SLAMF6+SPL0细胞可以产生致病性PL1细胞，并在EAE期间补充这些细胞。为了验证假设，首先分析了SPL0和SPL1细胞之间的TCR序列共享程度，发现它们之间存在大量克隆共享，覆盖了20%的SPL0细胞和50%的SPL1细胞。SPL0细胞跨越不同的TCR基因库，扩增的克隆较少，这与不同因子诱导的稳态群体相一致，而SPL1的基因库多样性较低，但扩增较多。与SPL0细胞相比，共享克隆型在SPL1细胞中高度扩增。为了测试SPL0到SPL1细胞的体内转化，将来自EAE小鼠的SLAMF6+或CXCR6+细胞转移到具有先天标记的免疫受体小鼠中。移植SLAMF6+供体细胞后，恢复了SLAMF6+和CXCR6+细胞，证实了SLAMF6+细胞在体内产生CXCR6+细胞的能力。相反，在转移CXCR6+供体细胞后，仅在受体脾脏中恢复CXCR6+细胞，但几乎没有SLAMF6+细胞，这表明CXCR6+细胞表现出末端效应细胞表型。最后，通过使用普遍表达光转换荧光蛋白的Kaede小鼠进行光转换实验，直接验证了脾脏和中枢神经系统中肠细胞向XCR6+细胞的迁移和转化。在免疫小鼠肠道细胞光转换后，在脾脏和CNS中检测到光转换的CXCR6+CD4+T细胞，这些细胞表达IFN-γ和GM-CSF，证实肠道细胞是致病性CXCR6+细胞的储库，这些细胞迁移到CNS以引起神经炎症。图4：稳态和致病性脾脏Th17群体在体内表现出不同的迁移行为。
目前尚不清楚产生IL-17的Th17细胞或产生GM-CSF和IFN-γ的T细胞的独特亚群是否是导致自身免疫组织炎症的关键致病细胞。为了阐明这个问题，检测了稳态SLAMF6+和致病性CXCR6+细胞的scRNA序列中编码关键细胞因子的基因的表达模式。有趣的是，SPL0细胞表达Il17a、Il17f和Il2的比例明显较高，而SPL1细胞表达Csf2和Ifng的比例较高。这种细胞因子基因表达被MOG召回试验证实为抗原特异性，因为SLAMF6+细胞在用MOG肽体外刺激后显示出IL-17A和IL-2阳性率增加，而CXCR6+细胞在肽刺激后显示出GM-CSF和IFN-γ阳性率和表达水平显著增加。这表明产生IL-17的Th17细胞和产生GM-CSF-和IFN-γ的T细胞在EAE的诱导中都有作用，因此稳态IL-17+群体产生GM-CSF+IFN-γ+T细胞。此外，表达IFNGR1的促炎性CXCR6+SPL1细胞比例较高，表明IFN-γ介导的自分泌正反馈环在扩展或维持SPL1表型方面起作用。
IL-23信号在自身免疫发病机制中起着关键作用，是致病性T细胞生成所必需的，但其驱动致病性T细胞生成的机制尚不清楚。有趣的是，IL-23受体（IL-23R）在SPL0中的表达比例高于SPL1细胞，而在CXCR6+和SLAMF6+细胞中，IL-23信号在SPL1细胞中的表达更高，在IL-23R信号下游的基因位点上的染色质可及性更高，提示CXCR6+细胞中有更大的IL-23R信号传导。假设IL-23R信号可能介导SLAMF6+向CXCR6+细胞的转化。为了验证假设，在体外将SLAMF6+细胞与脾细胞共同培养，并用IL-23处理它们。在IL-23存在的情况下，SLAMF6+细胞的比例降低，而GM-CSF+、IFN-γ+和CXCR6+细胞的比例增加，这表明IL-23R信号介导了稳态干细胞样Th17细胞向致病性CXCR6+细胞的转化。最后，为了表征IL-23R信号对体内致病性CXCR6+细胞生成的影响，构建了IL-23R条件敲除小鼠并在Il17aCreIl23rfl/fl小鼠中诱导EAE，其中IL-23R在Th17细胞中被特异性删除。与野生型同窝对照组相比，发现脾脏中SLAMF6+细胞的频率增加，CXCR6+细胞显著减少，而且，中枢神经系统中的TDT+CD4+T细胞较少，表达GM-CSF和IFN-γ的细胞较少，并且小鼠对EAE的诱导具有抵抗力。Il17aCreIl23rfl/fl CXCR6+细胞的大量RNA序列显示，在没有IL-23R信号的CXCR6+群体中，有大量表达变化。总之，这些数据表明IL-23R信号介导SLAMF6+细胞产生致病性CXCR6+细胞。图5：IL-23R信号正在驱动从IL-17+SLAMF6+细胞生成GM-CSF+IFN-γ+CXCR6+细胞。
本文的研究提供了可能适用于各种自身免疫环境的机制性见解，针对干细胞样肠道Th17人群和IL-23R信号可以更好地控制许多人类自身免疫疾病的慢性和复发。但存在一定的局限，
本研究中的TCR分析统计数据，包括克隆扩展和克隆相似性评分，即使在标准化后，也可能对细胞数量有剩余依赖性。关于研究设计，研究集中于Th17谱系，包括所有曾经表达Il17a的CD4+T细胞，因此不考虑其他可能的T细胞谱系.在自身免疫性疾病中发挥重要作用，包括Th1细胞和Treg细胞。
教授介绍：
Vijay K. Kuchroo
Vijay Kuchroo博士是哈佛医学院Samuel L. Wasserstrom神经病学教授，布莱根妇女医院的高级科学家，以及波士顿布里格姆研究所感染与免疫中心的联合主任。Vijay Kuchroo还是Broad研究所的研究所成员，也是Klarman细胞观测站项目和食物过敏科学倡议（FASI）项目的高级研究员。他是哈佛医学院和布莱根妇女医院恒大免疫疾病中心的创始主任。他的主要研究兴趣包括自身免疫性疾病- 特别是共刺激的作用 - 实验性自身免疫性脑脊髓炎和多发性硬化症的遗传基础，以及调节诱导T细胞耐受性和功能障碍的细胞表面分子和调节因子。他的实验室已经制造了几只转基因小鼠，作为人类多发性硬化症的动物模型。他的实验室还首先描述了TIM基因家族，并将Tim-3鉴定为T细胞上表达的抑制受体，现在正被用于癌症免疫治疗。他首先描述了一种高致病性Th17细胞的发展，这种细胞已被证明可以在人类中诱导多种不同的自身免疫性疾病。由Kuchroo博士撰写的一篇描述Th17发展的论文是免疫学中引用次数最高的论文之一。
参考文献：
Schnell et al., Stem-like intestinal Th17 cellsgive rise to pathogenic effector T cells during autoimmunity,Cell (2021),https://doi.org/10.1016/j.cell.2021.11.018