以PBMC数据集进行探索
1 创建对象
library(Seurat)
pbmc.data <- Read10X(data.dir ="./")
class(pbmc.data)
dim(pbmc.data)
2 创建对象
pbmc <- CreateSeuratObject(counts = pbmc.data,
project = "pbmc3k", min.cells = 3, min.features = 200)
Seurat通过CreateSeuratObject函数创建对象后，将我们导入的UMI count原始稀疏矩阵储存在pbmc@assays[["RNA"]]@counts，此外Seurat自动计算每个细胞总的UMI count，即每一列数字之和，储存在[email protected][["nCount_RNA"]]；计算每个细胞总的基因数，即每一列中非0的行数，储存在[email protected][["nFeature_RNA"]]
我们也可以自己计算验证：
2.1 计算nCount_RNA
2.1.1 手动计算每一个细胞的UMI count数
matrix<-as.matrix(pbmc@assays[["RNA"]]@counts)
a<-apply(matrix,2,sum) #2对列操作，1对行操作，sum求和
head(a)
#AAACATACAACCAC-1 AAACATTGAGCTAC-1 AAACATTGATCAGC-1
# 2419 4903 3147
#AAACCGTGCTTCCG-1 AAACCGTGTATGCG-1 AAACGCACTGGTAC-1
# 2639 980 2163
2.1.2 与Seurat自动计算的结果作对比
head([email protected][["nCount_RNA"]])
#[1] 2419 4903 3147 2639 980 2163
head(pbmc[["nCount_RNA"]])
# nCount_RNA
#AAACATACAACCAC-1 2419
#AAACATTGAGCTAC-1 4903
#AAACATTGATCAGC-1 3147
#AAACCGTGCTTCCG-1 2639
#AAACCGTGTATGCG-1 980
#AAACGCACTGGTAC-1 2163
[email protected][["nCount_RNA"]]结果为向量，pbmc[["nCount_RNA"]]结果为矩阵
2.2 计算nFeature_RNA
手动计算前六个细胞的基因Feature_RNA数
#提取并将稀疏矩阵转换为普通矩阵
b=as.matrix(pbmc@assays[["RNA"]]@counts)
e=NULL
for (i in 1:6) {c=nrow(subset(b,b[,i] != 0));e=append(e,c)}
print(e)
#[1] 779 1352 1129 960 521 781
与Seurat自动计算的结果作对比
head([email protected][["nFeature_RNA"]])
#[1] 779 1352 1129 960 521 781
2.2 计算线粒体基因UMI count百分比
手动计算
matrix<-as.matrix(pbmc@assays[["RNA"]]@counts)
a<-apply(matrix,2,sum)
b<-matrix[grep("MT-", row.names(matrix),ignore.case = T),]
l=apply(b,2,sum)
e=NULL
for (i in 1:6) {f=l[i]*100/a[i];e=append(e,f);}
print(e)
#AAACATACAACCAC-1 AAACATTGAGCTAC-1 AAACATTGATCAGC-1
# 3.0177759 3.7935958 0.8897363
#AAACCGTGCTTCCG-1 AAACCGTGTATGCG-1 AAACGCACTGGTAC-1
# 1.7430845 1.2244898 1.6643551
与Seurat自动计算的结果作对比
pbmc[["percent.mt"]] <- PercentageFeatureSet(object = pbmc, pattern = "^MT-")
head([email protected][["percent.mt"]])
#[1] 3.0177759 3.7935958 0.8897363 1.7430845 1.2244898
#[6] 1.6643551
2.3 标准化
手动计算第一列（细胞）标准化后的值
g<-as.matrix(pbmc@assays[["RNA"]]@counts)[,1]
a<-log(1+10000g/sum(g))
min(a);max(a);mean(a)
#[1] 0
#[1] 5.753142
#[1] 0.1170937
Seurat自动计算
pbmc <- NormalizeData(pbmc,
normalization.method = "LogNormalize",
scale.factor = 10000)
h<-pbmc@assays[["RNA"]]@data[,1]
min(h);max(h);mean(h)
#[1] 0
#[1] 5.753142
#[1] 0.1170937
标准化类似于RNA-seq的FPKM，计算公式为：In( 1 + ( UMIA ÷ UMITotal ) × 10000 )，R语言中log表示自然对数In（以e为底的对数），此处的 UMITotal即为每个细胞对应的nCount_RNA。
pbmc@assays[["RNA"]]@data在未标准化之前，储存的是原始稀疏矩阵，标准化后，储存的为标准化的矩阵。
2.3 归一化
目前还不知道手动计算公式。
pbmc <- ScaleData(pbmc, vars.to.regress = "percent.mt")
官方文档是这样说明的：
Shifts the expression of each gene, so that the mean expression across cells is 0
Scales the expression of each gene, so that the variance across cells is 1
This step gives equal weight in downstream analyses, so that highly-expressed genes do not dominate
翻译过来为：使每个基因在所有细胞中的平均年表达值为0，方差为1。这样在下游分析中，每个基因所占的权重是相同的，而不是高变基因占主导。
归一化后的矩阵储存在pbmc@assays[["RNA"]]@scale.data
归一化与标准化区别：
- 标准化是对每一列(细胞)操作，归一行对行（基因）操作
- 归一化后，每一行有一半数值变为负值，标准化后都是≥0的值
参考：
https://satijalab.org/seurat/archive/v3.0/pbmc3k_tutorial.html
https://satijalab.org/seurat/articles/pbmc3k_tutorial.html
scale函数对矩阵归一化是按行归一化，还是按列归一化？ - (jianshu.com)