sam/bam文件结合igv可视化

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Nickier

2019-01-12

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sam是一种序列比对后的输出格式，以tab作为分隔符，包括头部信息和比对信息。其中头部信息必须在比对信息之前。头部信息的开头是@，但是比对行不是。每一个比对行有11个重要的比对信息元素，如果比对位置和校准信息等。

关于sam/bam文件的格式，网上已经有很多介绍，但是很多没有结合igv可视化，所以不容易理解，今天，我们将sam/bam文件结合igv可视化，方便大家理解。

Example

ST-E00522:463:HT3TGCCXY:1:1210:30959:4702   163 chr1    10070   0   44S61M  =   10028   61  CCCTAATCCCTAACCCCTCACCCTCACCCTCACCTTCACCCTCCCCCTAATCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCAACCCTAACCCTAACCCTAACC   .==FB<+-+,CA<9*A8<-146BEF@FF4/A6A>/6*C14A5@EG+/>;C??DDD   MC:Z:6M1I6M1I91M    MD:Z:6C54   PG:Z:MarkDuplicates RG:Z:HT_11_DHE16602 NM:i:1  MQ:i:0  AS:i:56 XS:i:54

2019-01-12_232236.png

头文件

每个标题行以字符“@”开头，后面是两个字母的记录类型代码。在标题中，每一行都是由制表符分隔的，除了@CO行，每个数据字段都遵循格式“TAG:VALUE”，其中TAG是一个两个字母的字符串，定义了内容和值的格式。每个标题行应该匹配:/ ^ @[A-Za-z][A-Za-z](\ t[A-Za-z][A-Za-z0-9]:[- ~]+)+ $ /或/ ^ @CO \ t。* /。包含小写字母的标记保留给最终用户。

主要信息

每一个比对行有11个必填选项。这些字段都是以相同顺序出现，而且必须出现，但是这些值可以为0或*（取决于字段）如果无法获得相应的信息。下表概述了SAM格式的强制字段：

Col	Field	Brief description
1	QNAME	查询模板名称
2	FLAG	位标记，template mapping情况的数字表示，每一个数字代表一种比对情况，这里的值是符合情况的数字相加总和
3	RNAME	参考序列名称
4	POS	基于1的最左比对位置
5	MAPQ	MAPping质量
6	CIGAR	CIGAR字符串
7	RNEXT	比对到的参考（染色体）名字
8	PNEXT	配对到的第一个碱基的位置
9	TLEN	可以理解为文库插入片段长度
10	SEQ	序列片段
11	QUAL	phred -scale基本质量+33的ASCII码

1.QNAME：查询模板名称。具有相同QNAME的read片段被认为来自相同的模板。QNAME ' * '表示信息不可用。

QNAME.png

2.FLAG 位标记，下表是每一个代号代表的意义：

Bit	Description
1	read是pair中的一条（read表示本条read，mate表示pair中的另一条read）
2	pair一正一负完美的比对上
4	片段未比对上
8	mate没有比对上
16	这条read反向比对
32	mate反向比对
64	这条read是read1
128	这条read是read2
256	第二次比对
512	没有通过质量控制
1024	read是PCR或光学副本产生
2048	辅助比对结果

如下面这两条互相配对的reads中

ST-E00522:463:HT3TGCCXY:1:1217:29264:10662  99  chr1    10004   4   102M1I44M3S =   10195   236 CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCCAACCCTAACCCTAACCCGAACCCGAACCCGAACCCCAACCCCAACCCGAACCCCAACCCGAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAA  >CDHDEEEEFBDEEEFBEDCEFBEEEEEBEEECFBEDEEDCFDFFDCECCE4:E-->4=BCB9-?>?>F4.EABA@>E:C9&*==DCC&DE9C;,=@DAB&D?A?F9A?>8@AFC;>57A  XA:Z:chr22,-50808000,150M,11;chr22,-50808169,3S89M1I12M8D6M1D39M,16;chr1,+180761,41M2D44M3I17M3D45M,15;chr3,+10614,28M1I43M1D6M1D28M1D29M1D15M,11;chr22,-50808294,48M5D27M1I74M,16; MC:Z:7S45M  MD:Z:63T17T5T5T5T10T5T5T23  PG:Z:MarkDuplicates RG:Z:HT_11_DHE16602 NM:i:9  MQ:i:0  AS:i:99 XS:i:95
ST-E00522:463:HT3TGCCXY:1:1217:29264:10662  147 chr1    10195   0   7S45M   =   10004   -236    CCCCCACCCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCCTAACC    7F=0+.<>E?;+

第一条reads的第二列是99，即
99
=64（这条reads是read1）
+32（这条reads是正向比对）
+2（pair一正一负完美的比对上）
+1（这条reads是pair中的一条）

99.png

在上图中，可以看到linux界面中第一条和第二条reads即就是前面展示相互配对的reads。可以看到两条reads都比对到了chr1上了，此时就得到了1和2。而在igv中可以看到第一条reads（鼠标所在处）的方向是向右侧，即正向比对，就得到了数值32。至于64的由来，请看下图。

64.png

3.RNAME：比对的参考序列名称，如果@SQ头部行存在，RNAME(如果不是“”)必须出现在一个 SQ-SN标记中。没比对上此处就是“”。然而，一个未必对的片段也有一个坐标以便排序。如果RNAME 是“*”，也就没有 POS 和 CIGAR。

4.POS：于1的第一个匹配基的最左映射位置。参考序列中的第一个基的坐标是1。对于没有坐标的未映射读取，POS设置为0。如果POS为0，RNAME和CIGAR也就没有意义。

5.MAPQ：mapping质量，等于−10log 10Pr(映射位置是错的)，四舍五入到最近的整数，值255表示映射质量特别差。

6.CIGAR：CIGAR字符串。下表为CIGAR字符串的解释（‘*’表示无值）

Op	BAM	Description
M	0	比对匹配(可以是序列匹配或不匹配)
I	1	插入到参考
D	2	从参考删除
N	3	参考的跳过的区域
S	4	软剪切(被剪切的序列存在于序列中)
H	5	硬剪切(被剪切的序列不存在于序列中)
P	6	填充(从填充引用中无声删除)
=	7	序列匹配
X	8	序列不匹配

• H 值出现在最初或者最后操作中
• S 可证在他们和CIRAG末尾字符串中只有H操作
• 对于mRNA到基因组的比对，一个N操作符代表内含子。对于其他类型的比对，没有定义N的解释。
• M/I/S/=/X操作的长度之和等于SEQ的长度。

7.RNEXT:：mate的reference sequence name，实际上就是mate比对到的染色体号，若是没有mate，则是*

8.PNEXT：如果没有这个信息（没比对上）就是0

9.TLEN：如果R1端的read和R2端的read能够mapping到同一条Reference序列上（即第三列RNAME相同），则该列的值表示第8列减去第4列加上第6列的值，R1端和R2端相同id的reads其第九列值相同，但该值为一正一负，R1文件的reads和R2文件的reads，相同id的reads要相对来看。在进行该第列值的计算时，如果取第6列的数值，一定要取出现M的值，S或H的值不能取。

10.SEQ：reads片段。如果序列不存在，就是。如果不是，这个序列的长度等于CIGAR中 M/I/S/=/X的总和。=表示他的基础字段（如开始为1），和参考序列的基础字段相同。

11.QUAL：碱基质量加33的ASCII码（与Sanger FASTQ格式中的质量字符串相同）。一个碱基质量是基于错误率的phred-scaled等于−10log 10Pr(碱基是错的)。这个字段可以是“”。如果它不是，那么seq也不是“*”，它的长度与SEQ的长度得一致。