敲低Circ-MBOAT2靶向调控miR-433-3p/GOT1轴抑制胰腺癌的肿瘤进展和谷氨酰胺分解代谢

本次向大家推荐一篇来自武汉协和医院副主任医师-彭涛在J Exp Clin Cancer Res杂志投的一篇文章，文章题目“Circ-MBOAT2 knockdown represses tumor progression and glutamine catabolism by miR-433-3p/GOT1 axis in pancreatic cancer”，这是刚刚在该杂志发表的，影响因子：7.068分，内容主要讲的是敲低Circ-MBOAT2靶向调控miR-433-3p/GOT1轴从而抑制胰腺癌的肿瘤进展和谷氨酰胺分解代谢。

研究背景

胰腺癌是一种恶性肿瘤，在所有癌症中的发病率排名第六。据报道，环状RNA（circRNA）调节胰腺癌的进展，在原来的一些基础研究中，作者发现含有2个环膜结合的O-酰基转移酶结构域（circ-MBOAT2）在胰腺癌组织标本和细胞样本中高表达，但是尚不清楚circ-MBOAT2对胰腺癌过程的调节作用。在miRNA的确认中，有相关研究表明miR-433-3p能够抑制肿瘤发生的过程，以至作者选用它作为circ-MBOAT2相互作用的研究对象，通过网站预测发现miR-433-3p和circ-MBOAT2有相互结合的位点；在下游靶基因的选择中，作者选择了癌症细胞增殖所必须的一种物质——谷草转氨酶（GOT1），其在谷氨酸代谢中非必须氨基酸的产生起到至关重要的作用，也有相关研究报道谷草转氨酶对胰腺癌的增殖有着促进的作用。根据这些基础工作，作者提出了在胰腺癌肿瘤进展过程中，circ-MBOAT2通过海绵吸附作用miR-433-3p从而使GOT1表达对肿瘤细胞的增殖有着促进作用。

研究结果

1、Circ-MBOAT2在胰腺癌组织和细胞中高表达

作者通过QPCR的方法检测胰腺癌组织和细胞中几个感兴趣的circRNA，结果发现Circ-MBOAT2在胰腺癌组织以及细胞中高表达（如下图A）。为了判断所发现的Circ-MBOAT2为环状结构，将提取的RNA加入RNase R，接着检测Circ-MBOAT2在样本中的稳定性，结果发现，在样本中Circ-MBOAT2含量并没有减少（如下图C-D），作者接下来为了检测Circ-MBOAT2在细胞中的定位，将样本进行核质分离，分别检测Circ-MBOAT2的含量，结果表明Circ-MBOAT2主要存在于细胞质中（如下图E-F）

2、敲低Circ-MBOAT2对胰腺癌细胞功能的影响

作者继续探讨Circ-MBOAT2是否调节胰腺癌的形成，通过敲低Circ-MBOAT2（si- Circ-MBOAT2）在PANC-1 and SW1990的表达，观察细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡以及谷氨酸-草酰乙酸转氨酶1（GOT1）、α-酮戊二酸、谷氨酸的mRNA表达水平，这些结果表明了在细胞水平上敲低Circ-MBOAT2的表达，能够抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭、迁移以及下游通路中相关基因mRNA水平的降低，从而引起肿瘤细胞的凋亡（如下图A-J）。

3、敲低Circ-MBOAT2胰腺癌细胞在动物体内的成瘤观察

通过成功构建敲低Circ-MBOAT2稳转细胞株（Sh- Circ-MBOAT2+SW1990），皮下接着裸鼠，结果发现，在相同的成瘤时间，敲低Circ-MBOAT2的细胞株成瘤能力明显降低，运用QPCR技术检测瘤体中Circ-MBOAT2 mRNA表达水平，结果表明敲低Circ-MBOAT2组中Circ-MBOAT2的mRNA表达显著低于Circ-MBOAT2组（如图A-D）。

4、Circ-MBOAT2海绵吸附miR-433-3p相结合

在双荧光素梅实验中，通过构建包含miR-433-3p潜在结合序列的Circ-MBOAT2重组荧光宿酶报告质粒pGL3-Circ-MBOAT2-WT及包含突变了结合序列的重组质粒pGL3-Circ-MBOAT2-MUT；通过瞬转的方式把重组质粒pGL3-Circ-MBOAT2-WT以及pGL3-Circ-MBOAT2-MUT分别跟miR-433-3p mimic共转到两株人胰腺癌细胞PANC-1 and SW1990中，同时也设了分别跟miR-NC共转到细胞中；结果如图所示，在pGL3-Circ-MBOAT2-WT+miR-433-3p mimic组中，相对荧光素酶活性显著抑制相对于pGL3-Circ-MBOAT2-MUT+miR-433-3p mimic、pGL3-Circ-MBOAT2-WT+miR-NC和pGL3-Circ-MBOAT2-MUT+miR-NC，说明了Circ-MBOAT2和miR-433-3p能够相互结合。

通过实时荧光定量PCR检测34对胰腺癌组织和旁癌组织中miR-433-3p的表达，结果表明在胰腺癌组织中miR-433-3p显著表达（如图E）；通过斯皮尔曼相关分析，Circ-MBOAT2和miR-433-3p呈负相关（如图F）；在PANC-1和SW1990细胞中，Circ-MBOAT2显著高表达，而miR-433-3p显著低表达（如图G和H）；然而在这两株细胞中，通过si- Circ-MBOAT2敲减其在细胞中的表达检测miR-433-3p mRNA表达水平，发现miR-433-3p显著上升(如图I)。

5、Circ-MBOAT2通过miR-433-3p调节胰腺癌的发展

作者通过上面的实验证实了Circ-MBOAT2能海绵吸附miR-433-3p相结合的作用方式，进一步通过实验设计Circ-MBOAT2是否通过miR-433-3p调节胰腺癌的发展。在PANC-1 和SW1990细胞中，通过合成miR-433-3p inhibitor在细胞中敲低miR-433-3p，QPCR技术检测细胞中miR-433-3p mRNA表达水平，合成的miR-433-3p inhibitor起到一个很好的敲低作用（如下图A）；接着作者通过在两株细胞中瞬转si-Circ-MBOAT2-NC、si-Circ-MBOAT2、si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p inhibitor以及si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p inhibitor-NC四组，分别做了细胞增殖实验、平板克隆形成实验、细胞凋亡、侵袭、迁移、检测谷氨酰胺消耗、α-酮戊二酸产生和谷氨酸产生来解释Circ-MBOAT2通过海绵吸附miR-433-3p作用调节胰腺癌的发展以及谷氨酰胺分解代谢，在细胞凋亡实验中，si-Circ-MBOAT2、si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p NC这两组细胞凋亡水平无显著变化，但是相对于si-Circ-MBOAT2-NC和si-Circ-MBOAT2+miR-433-3p inhibitor这两组，凋亡水平显著上升的趋势（如下图F）；剩下的实验结果和细胞凋亡结果相反（如下图C-E、G-K）

6、胰腺癌细胞中miR-433-3p和GOT1相互结合作用

同样进行双荧光素梅实验，构建miR-433-3p潜在结合下游靶基因GOT1 3’UTR的重组荧光素梅报告质粒pGL3-GOT1 3’UTR-WT和突变了结合序列的重组质粒pGL3-GOT1 3’UTR-MUT。实验结果表明miR-433-3p能和GOT1相结合，在pGL3-GOT1 3’UTR-WT+miR-433-3p mimic组中荧光强度显著降低（如下图A-C）。

同样取34对胰腺癌组织和旁癌组织做QPCR和WB实验检测GOT1表达水平，结果表明在胰腺癌组织中GOT1 mRNA水平以及蛋白水平高表达，说明了GOT1在对胰腺癌的研究中有着重要的作用。在细胞层面上也检测了GOT1的表达水平，相对于HPDE正常胰腺上皮细胞，PANC-1和SW1990两株胰腺癌细胞中的GOT1同样是高表达；miR-433-3p和GOT1的表达水平呈负相关；接着通过在细胞中瞬转miR-433-3p inhibitor和miR-433-3p mimic检测GOT1蛋白表达水平，发现在miR-433-3p inhibitor组中，GOT1蛋白表达水平显著上升。

7、miR-433-3p作用于下游靶基因GOT1调控胰腺癌进展和谷氨酰胺代谢

作者通过在PANC-1和SW1990细胞中分别瞬转miR-NC、miR-433-3p mimic、miR-433-3p mimic +pcDNA以及miR-433-3p mimic+pcDNA- GOT1四组，后面分别检测细胞增殖、细胞凋亡、侵袭、迁移、检测谷氨酰胺消耗、α-酮戊二酸产生和谷氨酸产生，这些结果表明了，miR-433-3p作用于下游靶基因GOT1从而抑制细胞增殖、迁移、侵袭和谷氨酰胺代谢，从而促进细胞凋亡（如下图A-K）。

8、Circ-MBOAT2通过miR-433-3p调控GOT1表达

作者从上面一系列的实验证实了Circ-MBOAT2能海绵吸附作用miR-433-3p，而miR-433-3p能够跟下游靶基因GOT1相互作用从而调控胰腺癌的发展，所以作者提出了circMBOAT2是否通过分泌miR-433-3p调控GOT1的表达。结果显示，PANC-1和SW1990细胞中的circ-MBOAT2沉默显著下调了GOT1的mRNA和蛋白质水平；但是miR-433-3p inhibitor能够回挽这种影响（如下图A-B）。

总结

本研究指出Circ-MBOAT2通过miR-433-3p/GOT1轴调节胰腺癌的肿瘤发展和谷氨酰胺分解代谢。这一发现提示circ-MBOAT2可能是胰腺癌的治疗靶点。