ceRNA机制研究案例（二）

一、调控通路：

LncRNA MD1上有一段miR-133的前体序列。在细胞分化前，HuR蛋白结合到Lnc-MD1上抑制Lnc-MD1的剪切断裂，Lnc-MD1作为miR-133的海绵吸附体使miR-133前体序列结合miR-133，解除miR-133对HuR Mrna翻译的抑制促进HuR的表达。在细胞分化时，Lnc-MD1断裂释放miR-133前体使miR-133表达升高，miR-133结合到HuR mRNA的3’-UTR上抑制HuR的表达从而使得Lnc-MD1又可作为miR-133的前体。

二、实验流程：

作者首先进行荧光素酶实验检测HuR与Lnc-MD1的关系以及对Lnc-MD1过表达和敲低后检测HuR的表达，表明LncMD1对HuR的促进作用。随后分别用RIP和RNA pull-down来验证Lnc-MD1与HuR、Ago2的结合，用RNA-RNApull-down验证Lnc-MD1与miR-133结合。然后通过EMSA实验验证HuR与Lnc-MD1并验证了与Lnc-MD1的结合位点说HuR结合到Lnc-MD1上的miR-133前体序列上。最后作者通过检测细胞分化过程中的Lnc-MD1、miR-133和HuR的表达，以及检测HuR敲低后的Lnc-MD1的表达，表明HuR抑制Lnc-MD1转变为miR-133。

三、核心FIGURE：

Figure 1.说明的是Lnc-MD1对HuR蛋白表达的影响

A-C、荧光素酶实验，将HuR mRNA3’-UTR连接到荧光素酶报告质上 与Lnc-MD1表达质粒共转染后检测细胞的荧光素酶活性。

E、Q-PCR检测Lnc-MD1过表达/敲低，WB检测Lnc-MD1过表达/敲低后HuR蛋白的表达。表明Lnc-MD1促进HuR的表达。

Figure2说明的是HuR与Lnc-MD1结合后，Lnc-MD1作为miR-133的吸附体结合miR-133。

A、RIP实验，用HuR蛋白抗体从小鼠和人的细胞中钓取与HuR结合的RNA，然后进行Q-PCR检测，表明HuR与Lnc-MD1结合。

B、Ago2-RIP，用Ago2抗体钓取与Ago2蛋白结合的RNA，然后然后进行Q-PCR检测，表明Ago2与Lnc-MD1结合。

C、RNA pull-down/RNA-RNA pull-down，用Lnc-MD1探针钓取与之结合蛋白和RNA，产物进行WB和Q-PCR检测，表明Lnc-MD1能与HuR、Ago2蛋白结合，也与miR-133高度结合。

D、EMSA实验，用Lnc-MD1探针与HuR进行体外结合实验，表明lnc-MD1包含miR-133序列区段与HuR结合。

E、EMSA实验，用MD1-133b探针与冷探针进行体外结合HuR实验，表明两者具有竞争关系。

F、EMSA实验，用MD1-133b探针、突变探针和HuR进行体外结合实验，突变后的MD1-133不与HuR结合。

Figure3说明的是HuR对Lnc-MD1和miR-133的影响

A、细胞分化过程中WB检测HuR，RT-PCR检测Lnc-MD1，NB检测miR-133的表达。表明在细胞分化中期（48-72h）HuR和Lnc-MD1表达升高，在分化后期HuR和Lnc-MD1表达下降，而pre-miR-133b和miR-133b的表达升高。

B、Lnc-MD1作为miR-133前体的示意图。

C、Q-pcr检测HuR敲低后Lnc-MD1、pre-miR-133b和miR-133b的表达，表明HuR敲低后，Lnc-MD1下降，pre-miR-133b和miR-133b升高。

参考文献：Ivano Legnini,MariangelaMorlando,Arianna Mangiavacchi，et al.A Feedforward Regulatory Loop between HuR andthe Long Noncoding RNA linc-MD1 Controls Early Phases of Myogenesis.Molecular Cell,2013,53, 506–514