第八讲：单细胞轨迹推断分析
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练习地址：https://github.com/NBISweden/excelerate-scRNAseq/blob/master/session-trajectories/session-trajectories.md
轨迹推断分析可以帮助我们理解细胞状态的改变的过程，尤其是在细胞分化方面。
上图眼熟吧？是单细胞分析的一个经典的流程。做完聚类后，如果需要你可以做轨迹分析，通过轨迹分析你可以做差异基因的分析，从而得到细胞在分化过程中不同状态下的基因表达差异。当然中间的流程是经典流程，你也可以根据你的需要从不同的步骤跳到轨迹分析。
那么实验时间点的这个"time"，和发育的“time”有什么不一样。前者就是我们平时说的“时间”，而后者说的是一种“拟时间”（pseudotime）。细胞按照拟时间的顺序来进行分化。上图中的坐标举的例子是，横坐标你用一种外界刺激使得细胞进行分化，那么纵坐标就是细胞分化的进程。需要注意的是，即便你在每一步都是homogenous的细胞群，你的所有细胞的分化速度都是不一样的。比如上图的9h，尽管很多细胞已经完全的分化了，但是仍然有少数细胞处在中间态，和完全没有分化的状态。这也就是“非同步化”。所以，在任何一个节点，你的所有的细胞个体都代表“这个瞬间”的分化状态。
那是每个人都需要进行轨迹推断分析吗？当然不是。你需要确认的是你的dataset里是否涉及分化过程，或者你的细胞是否有“中间态”。比如：骨髓里的细胞，里面有很多“progenitor cells”，你就需要进行轨迹分析。再比如说你的样品来自血液，血液里都是已经分化成熟的细胞了，基本上不用进行轨迹分析了。需要注意的是：有时候轨迹分析的结果在生物学上并没有意义！所以最好是你已知一部分的分化轨迹，或者知道细胞在某一状态的时候会表达什么基因。
现在有很多种方法可以进行轨迹分析。请注意，不同的轨迹分析软件所对应的降维方法是不一样的。如上图所示。上图没有列出所有的降维方法，只是举一些例子。
在讲解轨迹分析方法之前，主讲人想先介绍两个之前没提到过的降维方法：第一种，ICA：
如果你用monocle v1的话，就是ICA的方法。这种方法与PCA非常相似。区别是：ICA是分解你的data，PCA则是把highest variation分配到highest component里。
现在来详细的看一下ICA到底是干什么的。上图所示，在你的样品里，包含有很多种生物signal，可能有受体信号、可能有细胞活化和增殖的信号、可能有细胞发育期间的Marker。但是当你把这些信号都combine的时候，就像右图。ICA做的事就是分解你的data，使得你可以看到原始的生物信号。
ICA是怎么工作的呢？上图左边是PCA的图，PCA是把highest variation找出来。作为第一主成分。而ICA是从你的data里找出最独立的成分。但是ICA也有缺点：ICA假设它所找出来的生物信号都是相互独立的。另一个就是每个信号的来源都是非高斯分布。这里不好理解，举个例子：在教室里放4个麦克风，然后所有人在说话的时候，我们需要区分出究竟谁在说话。ICA可以分解出每一个人的声音。这些声音就是非高斯分布的。而在生物信号里，大部分的情况下，信号来源都是高斯分布的。即便是对于单个细胞来说，你也很难说是高斯分布，还是非高斯分布。
ICA是一个线性降维方法。可以分解你data里的不同生物信号来源，这种降维方法对后面的轨迹分析比较有利，它可以分辨出哪个信号先出现，哪个信号后出现。但是这种方法有时候在分析单细胞数据的时候得到的结果并不真实。而且ICA默认的是所有的信号来源是同等重要的，但事实并不是。
下一个主讲人想讲的是另一种之前没提到的降维方法，diffusion maps。
diffusion maps是一种非线性降维方法。它是基于计算“probability”进行工作的。举个例子：从点1到点6，你可以选择一条路径1>2>6。这就是2步。你也可以选择3步，比如1>4>5>6和1>4>7>6。它计算的是“可能性”。
简单的来说：为了把可能性转化成距离，DM计算B到C的可能性，再计算A到C的可能性，根据公式，如果两种可能性差不多大，那么它们的差值就趋近于0。说明A到B的过程可以通过C来很好的连接起来。
在了解了两种降维方式之后，我们可以来看如何建立细胞之间的关系。从而我们可以知道我们应该从哪里开始建立轨迹，又在哪里结束。一种方法叫做“MST”（翻译过来叫：最小生成树）。
先来举个简单的例子，上图里有很多个点，每一个点之间的距离你都可以量的出来。或者你用上面提到的diffusion map可以计算出每个点之间的“可能性”。然后你可以把每一个点连线，黑色的粗线就是最小生成树。怎么理解呢？为什么说是最小生成树呢？这个“最小”怎么理解？我们要找到一个“把所有的点连在一起时，相加的数最小”的方式。（把这句加粗的句子多读几遍，就理解了）另外加一句，如果你分析前就知道你的发育起始点，或者例如干细胞，那就会相对容易很多。
需要注意的是：MST没有循环！所以如果你研究的生物过程是细胞增殖（周期），那你就不能用这个方法。
第二个方法建立细胞轨迹，这个方法就是现在monocle 2使用的方法。叫做反向图嵌入。
为什么使用这个方法呢？上图，A比如说是一个最小生成树得到的轨迹推断。如果你把其中一个点的位置稍稍挪一下，像B图那样，你会发现细胞轨迹完全就改变了！因为最小生成图非常依赖于每一个点。所以这个RGE的方法是像C图一样，先把你的细胞或者样品做cluster，根据这些细胞的平均值来画轨迹图。
上图显示的是RGE的一个工作原理图。从左上角的红点那个图看起，你有很多个点在多维的空间里。然后你用各种方法做了降维（第一行中间图）。之后根据一些clustering来假设一个轨迹。接下来（第二行右图）RGE所做的事就是：由于有些点离这个假设的轨迹比较远，它就把每一个点分配到离点最近的轨迹的部分上。然后更新中心点，将二维的轨迹投影到多维空间里，比较是否和原始的数据相吻合，如果不是，它会再回到降维后的那一步，循环这个过程。这个过程实际上很像前面讲降维里的tSNE和UMAP的循环。直到这个细胞轨迹与原始data非常符合。这时你可以选择这个轨迹的root，这样你就可以定义你的“拟时间”或者是“发育轨迹”了。另外根据你的轨迹图里的“分叉”，你还可以定义你的cell fate。
根据RGE的idea，这两年又发展不少新的方法。你不需要掌握这么多方法，会一个，会用就行了。
这是Monocle v3的一个工作流程。首先拿到你的dataset> 标准化你的data > 降维> 聚类 > 建立你的tree（拟时间）> 差异基因分析。
现在介绍一个新的模型：RNA velocity。有道翻译：RNA速度。这个模型是基于生物学概念的一个模型。是一个基因表达的轨迹推断模型。
学生物的都知道，mRNA刚转录出来的时候，是没有经过剪切的。里面有内含子。剪切后，你会得到spliced mRNA。这是编码蛋白的。你同时还会有一些mRNA降解。这个模型可以看什么？上图右边的6张图，每一个点是一个细胞，你可以比较在拟时间线上的一个瞬时的点，“经过剪切的mRNA”和“未经剪切的mRNA”哪一个要更提前。
来看一个更为直接的例子：上图红色代表未剪切的mRNA，蓝色代表剪切的mRNA，两个群分别代表你所有的细胞的两个基因的表达情况。根据生物学概念来推断，你的这些细胞的状态应该是从左往右的。所以这样一来，你就知道你的轨迹应该是从哪里开始了。这个模型可以让你定义你的轨迹的“起点”、“终点”和“分支”。
这个模型的好处还有一个：它可以建立一个循环的轨迹。
下面总结一下：
在实际的实验中，多维空间里的距离常常反映了细胞群之间的基因表达差异，而不是真正意义上的“时间”。所以才把这一个概念称为“拟时间”。你的样品里需要包含一个连续的细胞状态。如果你的细胞群是完全独立的、完全不同的，有可能你会得到错误的结果，或者得到一个不太好的轨迹图。第三，如果你是研究细胞分化过程，最好设计多个实验取材的时间点。