去内毒素中量质粒提取步骤

操作步骤

(请自备50mL离心管、20mL离心管、异丙醇、70%乙醇)

1. 取50mL菌液，置于50mL离心管中，4000rpm 4℃离心5min，彻底弃除上清。

2. 加入3mL溶液A，充分振荡2min，使菌体充分悬浮，确保无絮块存在。4000rpm 4℃离心5min，彻底弃除上清。

3. 加入2mL溶液I和40uL溶液B，充分振荡2min，使菌体充分悬浮，确保无絮块存在。

4. 加入4mL溶液II，盖紧管盖，轻轻颠倒混匀6次，注意整个管子的内表面均需与溶液II接触，室温放置至溶液清亮。（一般为4-5min，如5min后溶液未变清亮，说明细菌过多，应考虑减少菌液量。注意混匀手法要温和，不要剧烈混合）

5.加入3mL溶液III，盖紧管盖，立即轻轻颠倒混匀8次，4℃放置5min。（此步注意要尽快混匀，但手法要温和）

6. 10000rpm 4℃离心15min，小心吸出上清，轻移至新的20mL离心管。（应在离心机自动停转后取出离心管，以免沉淀悬浮）

7. 加入6mL异丙醇，充分混匀，室温放置5分钟。10000rpm室温离心12min，小心吸弃上清，用吸水纸尽量吸去残余的液体。

（应在离心机自动停转后取出离心管，以免沉淀悬浮）

8. 3mL 70%乙醇，温和震荡30Sec，10000rpm离心10min，轻轻弃去上清，用吸水纸尽量吸去残余的液体，室温晾干沉淀。

9. 加入0.3mL溶液IV，温和震荡2min，使沉淀完全溶解并转移至新的1.5mL离心管中。

10. 加入10%体积溶液V，充分混匀，冰浴5min。

11. 加入3%体积溶液VI，反复吹打混匀，旋涡震荡15min。

12. 50℃水浴5min，室温12000rpm离心3min，溶液分相后，吸取上层水相至新的离心管中。

13.重复步骤10~12两次。

14. 加入700uL无水乙醇，充分混匀，室温放置5分钟。12000rpm离心10min，小心吸弃上清，用吸水纸尽量吸去残余的液体。

15. 加入700uL70%乙醇，温和震荡30Sec，12000rpm离心5min，轻轻弃去上清，将离心管倒置于吸水纸上，吸去残余液体，室温晾干沉淀。

16.加入50μL溶液IV，温和震荡2分钟，使沉淀完全溶解。

注意事项：

1、 溶液II、溶液III如出现结晶或者沉淀，可在37℃水浴中加热几分钟溶解，直至液体恢复澄清。

2、 提取的BIOG质粒量与细菌培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。如所提质粒为低拷贝质粒或者大于10kb的大质粒，应加大菌体使用量，同时按比例增加溶液I、溶液B、溶液II、溶液III的用量。