__一蓑烟雨__
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2021-10-10给学徒的WES数据分析流程

首先安装软件

先安装conda，使用清华的conda，说明书：https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/help/anaconda/
然后下载安装miniconda，位置：https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/ ，更改镜像配置
下载安装软件之前先搜索是否存在 https://bioconda.github.io/recipes.html

更改镜像源配置如下：

wget https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/miniconda/Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh conda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/pkgs/freeconda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/conda-forgeconda config --add channels https://mirrors.tuna.tsinghua.edu.cn/anaconda/cloud/biocondaconda config --set show_channel_urls yes

然后就可以根据流程来使用conda安装一系列软件

conda  create -n wes  python=2 bwaconda info --envssource activate wes# 可以用search先进行检索conda search sratools## 保证所有的软件都是安装在 wes 这个环境下面conda install sra-toolsconda install samtoolsconda install -y bcftools vcftools  snpeffconda install -y multiqc qualimap # https://software.broadinstitute.org/gatk/download/https://github.com/broadinstitute/gatk/releases/download/4.0.6.0/gatk-4.0.6.0.zipcd ~/biosoftmkdir -p gatk4 &&  cd gatk4wget  https://github.com/broadinstitute/gatk/releases/download/4.0.6.0/gatk-4.0.6.0.zipunzip gatk-4.0.6.0.zip## 然后下载100G的必备数据才能使用GATK

熟悉参考基因组及必备数据库

/public/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/bwa_index/|-- [ 20K]  gatk_hg38.amb|-- [445K]  gatk_hg38.ann|-- [3.0G]  gatk_hg38.bwt|-- [767M]  gatk_hg38.pac|-- [1.5G]  gatk_hg38.sa|-- [6.2K]  hg38.bwa_index.log `-- [ 566]  run.sh /public/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/|-- [1.8G]  1000G_phase1.snps.high_confidence.hg38.vcf.gz|-- [2.0M]  1000G_phase1.snps.high_confidence.hg38.vcf.gz.tbi|-- [3.2G]  dbsnp_146.hg38.vcf.gz|-- [3.0M]  dbsnp_146.hg38.vcf.gz.tbi|-- [ 59M]  hapmap_3.3.hg38.vcf.gz|-- [1.5M]  hapmap_3.3.hg38.vcf.gz.tbi|-- [568K]  Homo_sapiens_assembly38.dict|-- [3.0G]  Homo_sapiens_assembly38.fasta|-- [157K]  Homo_sapiens_assembly38.fasta.fai|-- [ 20M]  Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg38.vcf.gz|-- [1.4M]  Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg38.vcf.gz.tbi

第一步是QC

包括使用fasqc和multiqc两个软件查看测序质量，以及使用trim_galore软件进行过滤低质量reads和去除接头。

mkdir ~/project/boywkd=/home/jmzeng/project/boymkdir {raw,clean,qc,align,mutation}cd qc find /public/project/clinical/beijing_boy  -name *gz |grep -v '\._'|xargs fastqc -t 10 -o ./

假设质量很差，就过滤：

### step3: filter the bad quality reads and remove adaptors. mkdir $wkd/clean cd $wkd/clean find /public/project/clinical/beijing_boy  -name *gz |grep -v '\._'|grep 1.fastq.gz > 1find /public/project/clinical/beijing_boy  -name *gz |grep -v '\._'|grep 2.fastq.gz > 2paste 1 2  > config### 打开文件 qc.sh ，并且写入内容如下： source activate wes bin_trim_galore=trim_galoredir=$wkd/cleancat config  |while read iddo        arr=(${id})        fq1=${arr[0]}        fq2=${arr[1]}         echo  $dir  $fq1 $fq2 nohup $bin_trim_galore -q 25 --phred33 --length 36 -e 0.1 --stringency 3 --paired -o $dir  $fq1 $fq2 & done  source deactivate

读质量较好的测序数据进行比对

先走测试数据

## 先提取小的fqsource activate wesfind /public/project/clinical/beijing_boy  -name *gz |grep -v '\._' > fq.txtcat fq.txt |while read id ;do (zcat $id|head -10000 > $(basename $id ".gz"));done## 然后一个个小fq文件比对sample='7E5239'bwa mem -t 5 -R "@RG\tID:$sample\tSM:$sample\tLB:WGS\tPL:Illumina"  /public/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/bwa_index/gatk_hg38 7E5239.L1_1.fastq 7E5239.L1_2.fastq  | samtools sort -@ 5 -o 7E5239.bam -sample='7E5240'bwa mem -t 5 -R "@RG\tID:$sample\tSM:$sample\tLB:WGS\tPL:Illumina"  /public/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/bwa_index/gatk_hg38  7E5240_L1_A001.L1_1.fastq 7E5240_L1_A001.L1_2.fastq  | samtools sort -@ 5 -o 7E5240.bam -sample='7E5241'bwa mem -t 5 -R "@RG\tID:$sample\tSM:$sample\tLB:WGS\tPL:Illumina"  /public/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/bwa_index/gatk_hg38 7E5241.L1_1.fastq 7E5241.L1_2.fastq   | samtools sort -@ 5 -o 7E5241.bam -## 或者循环比对# 7E5239    7E5239.L1_1.fastq   7E5239.L1_2.fastq# 7E5240    7E5240_L1_A001.L1_1.fastq   7E5240_L1_A001.L1_2.fastq# 7E5241    7E5241.L1_1.fastq   7E5241.L1_2.fastqINDEX=/public/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/bwa_index/gatk_hg38cat config |while read iddo arr=($id)fq1=${arr[1]}fq2=${arr[2]}sample=${arr[0]}bwa mem -t 5 -R "@RG\tID:$sample\tSM:$sample\tLB:WGS\tPL:Illumina" $INDEX $fq1 $fq2  | samtools sort -@ 5 -o $sample.bam -  done

然后走正常的数据

ls /home/jmzeng/project/boy/clean/*1.fq.gz >1ls /home/jmzeng/project/boy/clean/*2.fq.gz >2cut -d"/" -f 7 1 |cut -d"_" -f 1  > 0paste 0 1 2 > config source activate wesINDEX=/public/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/bwa_index/gatk_hg38cat config |while read iddo arr=($id)fq1=${arr[1]}fq2=${arr[2]}sample=${arr[0]}echo $sample $fq1 $fq2  bwa mem -t 5 -R "@RG\tID:$sample\tSM:$sample\tLB:WGS\tPL:Illumina" $INDEX $fq1 $fq2  | samtools sort -@ 5 -o $sample.bam -    done

最简单的找变异流程

如果要理解参数的意思，参考我的直播基因组 【直播】我的基因组25：用bcftools来call variation

ref=/public/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/Homo_sapiens_assembly38.fastasource activate westime samtools mpileup -ugf $ref  *.bam | bcftools call -vmO z -o out.vcf.gzls *.bam |xargs -i samtools index {}## 没有去除PCR重复

去除PCR重复

理解参数和教程为什么会过时

# samtools markdup -r 7E5241.bam 7E5241.rm.bam# samtools markdup -S 7E5241.bam 7E5241.mk.bam

完善的GATK流程

source activate wesGATK=/home/jmzeng/biosoft/gatk4/gatk-4.0.6.0/gatkref=/public/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/Homo_sapiens_assembly38.fastasnp=/public/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/dbsnp_146.hg38.vcf.gzindel=/public/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/Mills_and_1000G_gold_standard.indels.hg38.vcf.gz   for sample in {7E5239.L1,7E5240,7E5241.L1}do echo $sample  # Elapsed time: 7.91 minutes$GATK --java-options "-Xmx20G -Djava.io.tmpdir=./" MarkDuplicates \    -I $sample.bam \    -O ${sample}_marked.bam \    -M $sample.metrics \    1>${sample}_log.mark 2>&1   ## Elapsed time: 13.61 minutes$GATK --java-options "-Xmx20G -Djava.io.tmpdir=./" FixMateInformation \    -I ${sample}_marked.bam \    -O ${sample}_marked_fixed.bam \    -SO coordinate \    1>${sample}_log.fix 2>&1  samtools index ${sample}_marked_fixed.bam ##  17.2 minutes$GATK --java-options "-Xmx20G -Djava.io.tmpdir=./"  BaseRecalibrator \    -R $ref  \    -I ${sample}_marked_fixed.bam  \    --known-sites $snp \    --known-sites $indel \    -O ${sample}_recal.table \    1>${sample}_log.recal 2>&1     $GATK --java-options "-Xmx20G -Djava.io.tmpdir=./"   ApplyBQSR \    -R $ref  \    -I ${sample}_marked_fixed.bam  \    -bqsr ${sample}_recal.table \    -O ${sample}_bqsr.bam \    1>${sample}_log.ApplyBQSR  2>&1     ## 使用GATK的HaplotypeCaller命令$GATK --java-options "-Xmx20G -Djava.io.tmpdir=./" HaplotypeCaller \     -R $ref  \     -I ${sample}_bqsr.bam \      --dbsnp $snp \      -O ${sample}_raw.vcf \      1>${sample}_log.HC 2>&1   done

检查感兴趣基因区域内比对和找变异情况

通过IGV可视化来加深自己对这个流程的把握和理解。

chr17   HAVANA  gene    43044295        431702453.5G Jul 21 18:01 7E5240.bam7.1G Jul 21 21:40 7E5240_bqsr.bam4.7G Jul 21 20:28 7E5240_marked.bam4.8G Jul 21 20:44 7E5240_marked_fixed.bam

把这些bam里面的BRCA1基因的reads拿出来：

samtools  view -h  7E5240.bam chr17:43044295-43170245 |samtools sort -o  7E5240.brca1.bam -samtools  view -h  7E5240_bqsr.bam chr17:43044295-43170245 |samtools sort -o  7E5240_bqsr.brca1.bam -samtools  view -h  7E5240_marked.bam chr17:43044295-43170245 |samtools sort -o  7E5240_marked.brca1.bam -samtools  view -h  7E5240_marked_fixed.bam chr17:43044295-43170245 |samtools sort -o  7E5240_marked_fixed.brca1.bam -ls  *brca1.bam|xargs -i samtools index {}

有了这些特定基因区域的bam，就可以针对特定基因找变异

source activate wesref=/public/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/Homo_sapiens_assembly38.fastasamtools mpileup -ugf $ref   7E5240_bqsr.brca1.bam   | bcftools call -vmO z -o 7E5240_bqsr.vcf.gz

所有样本走samtools mpileup 和bcftools call 流程

仍然是参考我的直播基因组 【直播】我的基因组25：用bcftools来call variation

source activate weswkd=/home/jmzeng/project/boycd $wkd/align ls  *_bqsr.bam  |xargs -i samtools index {}ref=/public/biosoft/GATK/resources/bundle/hg38/Homo_sapiens_assembly38.fastanohup samtools mpileup -ugf $ref   *_bqsr.bam | bcftools call -vmO z -o all_bqsr.vcf.gz &

比对及找变异结果的质控

raw和clean的fastq文件都需要使用fastqc质控。

比对的各个阶段的bam文件都可以质控。

使用qualimap对wes的比对bam文件总结测序深度及覆盖度。

source activate weswkd=/home/jmzeng/project/boycd $wkd/cleanls *.gz |xargs fastqc -t 10 -o ./ cd $wkd/alignrm *_marked*.bamls  *.bam  |xargs -i samtools index {} ls  *.bam  | while read id ;do (samtools flagstat $id > $(basename $id ".bam").stat);done conda install bedtoolscat /public/annotation/CCDS/human/CCDS.20160908.txt  |perl -alne '{/\[(.*?)\]/;next unless $1;$gene=$F[2];$exons=$1;$exons=~s/\s//g;$exons=~s/-/\t/g;print "$F[0]\t$_\t$gene" foreach split/,/,$exons;}'|sort -u |bedtools sort -i |awk '{print "chr"$0"\t0\t+"}'  > $wkd/align/hg38.exon.bed  exon_bed=hg38.exon.bed ls  *_bqsr.bam | while read id;dosample=${id%%.*}echo $samplequalimap bamqc --java-mem-size=20G -gff $exon_bed -bam $id  & done  ### featureCounts gtf=/public/reference/gtf/gencode/gencode.v25.annotation.gtf.gzfeatureCounts -T 5 -p -t exon -g gene_id    \-a  $gtf   *_bqsr.bam -o  all.id.txt  1>counts.id.log 2>&1 &

比较两个找变异工具的区别

chr1    139213  .       A       G       388     .   DP=984;VDB=0.831898;SGB=-223.781;RPB=0.599582;MQB=0.0001971;MQSB=0.00457372;BQB=2.59396e-09;MQ0F=0.281504;ICB=0.333333;HOB=0.5;AC=3;AN=6;DP4=371,169,160,84;MQ=21GT:PL   0/1:198,0,255   0/1:176,0,255   0/1:50,0,158

chr1    139213  rs370723703 A   G   3945.77 .   AC=1;AF=0.500;AN=2;BaseQRankSum=-2.999;ClippingRankSum=0.000;DB;DP=244;ExcessHet=3.0103;FS=2.256;MLEAC=1;MLEAF=0.500;MQ=29.33;MQRankSum=-0.929;QD=16.17;ReadPosRankSum=1.462;SOR=0.863  GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:136,108:244:99:3974,0,6459chr1    139213  rs370723703 A   G   2261.77 .   AC=1;AF=0.500;AN=2;BaseQRankSum=-1.191;ClippingRankSum=0.000;DB;DP=192;ExcessHet=3.0103;FS=9.094;MLEAC=1;MLEAF=0.500;MQ=32.03;MQRankSum=-0.533;QD=11.78;ReadPosRankSum=0.916;SOR=0.321  GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:126,66:192:99:2290,0,7128chr1    139213  rs370723703 A   G   2445.77 .   AC=1;AF=0.500;AN=2;BaseQRankSum=-2.495;ClippingRankSum=0.000;DB;DP=223;ExcessHet=3.0103;FS=10.346;MLEAC=1;MLEAF=0.500;MQ=30.18;MQRankSum=0.486;QD=10.97;ReadPosRankSum=-0.808;SOR=0.300 GT:AD:DP:GQ:PL  0/1:152,71:223:99:2474,0,7901

补充作业

使用freebayes和varscan找变异。

VCF下游分析

主要是：注释和过滤

注释

VEP,snpEFF,ANNOVAR

1.Annovar使用记录 (http://www.bio-info-trainee.com/641.html)

2.用annovar对snp进行注释 (http://www.bio-info-trainee.com/441.html)

3.对感兴趣的基因call variation(http://www.bio-info-trainee.com/2013.html)

4.WES（六）用annovar注释(http://www.bio-info-trainee.com/1158.html)

cd ~/biosoft/ln -s /public/biosoft/ANNOVAR/ ANNOVARsource activate weswkd=/home/jmzeng/project/boycd $wkd/mutation  mv ../align/*.vcf ./  ~/biosoft/ANNOVAR/annovar/convert2annovar.pl  -format vcf4old    7E5240_raw.vcf  >7E5240.annovar ~/biosoft/ANNOVAR/annovar/annotate_variation.pl \-buildver hg38  \--outfile 7E5240.anno \7E5240.annovar \~/biosoft/ANNOVAR/annovar/humandb/

其实并不一定需要vcf文件，软件需要的只是染色体加上坐标即可，对于我们的vcf格式的变异文件， 软件通常会进行一定程度的格式化之后再进行注释。这里的注释主要有三种方式，分别是：

  • 基于基因的注释,exonic,splicing,ncRNA,UTR5,UTR3,intronic,upstream,downstream,intergenic
  • 基于区域的注释, cytoBand,TFBS,SV,bed,GWAS,ENCODE,enhancers, repressors, promoters
  • 基于数据库的过滤,dbSNP,ExAC,ESP6500,cosmic,gnomad,1000genomes,clinvar

如果要使用annovar一次性注释多个数据库

dir=/home/jianmingzeng/biosoft/ANNOVAR/annovardb=$dir/humandb/ ls $db wget https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/pub/clinvar/vcf_GRCh38/archive_2.0/2018/clinvar_20180603.vcf.gz  perl $dir/annotate_variation.pl  --downdb --webfrom annovar --buildver hg38 clinvar_20180603 $db# perl $bin  --downdb --webfrom annovar --buildver hg38 gnomad_genome $dbmkdir annovar_results  $dir/convert2annovar.pl -format vcf4old highQ.vcf  1> highQ.avinput  2>/dev/null perl $dir/annotate_variation.pl  -buildver hg38 -filter -dbtype clinvar_20180603  --outfile annovar_results/highQ_clinvar  highQ.avinput  $db perl $dir/table_annovar.pl   \-buildver hg38 \highQ.avinput  $db \-out test \-remove -protocol \refGene,clinvar_20170905 \-operation g,r \-nastring NA

补充作业

使用 Variant Effect Predictor 对所有遗传变异进行注释。过滤掉 dbSNP 数据库和千人基因组计划数据库中已知的 SNP。

应用 OMIM 数据库(http://omim.org/)查询蛋白 的结构及功能。利用 SIFT ，PolyPhen-2 以及 PROVEAN 软件, 预测 SNV 对蛋白质功能的影响 程度，仅当 3 种软件均预测同一遗传变异对蛋白质 的功能影响较大时，才认定该遗传变异具有高危害 性。利用 PROVEAN 软件 预测 Indel 对蛋白质功 能的影响。

其实dbNSFP数据库，就注释了这些变异对蛋白功能的影响。

变异位点的过滤

使用 GATK的 Joint Calling ， 过滤参考：https://mp.weixin.qq.com/s/W8Vfv1WmW6M7U0tIcPtlng

注意很多资料会过时

比如虽然可以找到了gatk3代码：http://baserecalibrator1.rssing.com/chan-10751514/all_p13.html 但是已经可以抛弃了，也就是说教程经常会过时。

GVCF 教程

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    昨天家人去泡温泉，二个孩子也带着去，出发前一晚，匆匆下班，赶回家和孩子一起收拾。饭后，我拿出笔和本子（上次去澳门时做手帐的本子）写下了1\2\3\4\5\6\7\8\9,让后让小壹去思考，带什么出发去旅游呢？她在对应的数字旁边画上了，泳衣、泳圈、肖恩、内衣内裤、tapuy、拖鞋……画完后，就让她自己对着这个本子，将要带的，一一带上，没想到这次带的书还是这本《便便工厂》(晚上姑婆发照片过来，妹妹累得
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    小丽发现，即使她好不容易调整好自己的心态下一秒总会有不确定的伤脑筋的事出现，一个接一个的问题，人生就没有停下的时候，小问题不断出现。不过她今天看的书，她接受了人生就是不确定的，厉害的人就是不断创造确定性，在Ta的领域比别人多的确定性就能让自己脱颖而出，显示价值从而获得的比别人多的利益。正是这样的原因，因为从前修炼自己太少，使得她现在在人生道路上打怪起来困难重重，她似乎永远摆脱不了那种无力感，有种习
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    昨天听了华中师范大学教育管理学系副教授张玲老师的《哪里才是学生心理健康的最后庇护所，超越教育与技术的思考》的讲座。今天又重新学习了一遍，收获匪浅。张玲博士也注意到了当今社会上的孩子由于心理问题导致的自残、自杀及伤害他人等恶性事件。她向我们普及了一个重要的命题，她说心理健康的一些基本命题，我们与我们通常的一些教育命题是不同的，她还举了几个例子，让我们明白我们原来以为的健康并非心理学上的健康。比如如果
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    前面分别介绍了数据源架构模式之表数据入口、数据源架构模式之行和数据入口数据源架构模式之活动记录，相较于这三种数据源架构模式，数据映射器显得更加“高大上”。   一、概念 数据映射器（Data Mapper）：在保持对象和数据库（以及映射器本身）彼此独立的情况下，在二者之间移动数据的一个映射器层。概念永远都是抽象的，简单的说，数据映射器就是一个负责将数据映射到对象的类数据。 &nb
  • 在Python中使用MYSQL pda158 mysqlpython
    缘由 　　近期在折腾一个小东西须要抓取网上的页面。然后进行解析。将结果放到 数据库中。 　　了解到 Python在这方面有优势，便选用之。 　　由于我有台 server上面安装有 mysql，自然使用之。在进行数据库的这个操作过程中遇到了不少问题，这里 记录一下，大家共勉。 　　 python中mysql的调用 　　 百度之后能够通过MySQLdb进行数据库操作。
  • 单例模式 hxl1988_0311 java单例设计模式单件
    package com.sosop.designpattern.singleton; /* * 单件模式：保证一个类必须只有一个实例，并提供全局的访问点 * * 所以单例模式必须有私有的构造器，没有私有构造器根本不用谈单件 * * 必须考虑到并发情况下创建了多个实例对象 * */ /** * 虽然有锁，但是只在第一次创建对象的时候加锁，并发时不会存在效率
  • 27种迹象显示你应该辞掉程序员的工作 vipshichg 工作
    1、你仍然在等待老板在2010年答应的要提拔你的暗示。 2、你的上级近10年没有开发过任何代码。 3、老板假装懂你说的这些技术，但实际上他完全不知道你在说什么。 4、你干完的项目6个月后才部署到现场服务器上。 5、时不时的，老板在检查你刚刚完成的工作时，要求按新想法重新开发。 6、而最终这个软件只有12个用户。 7、时间全浪费在办公室政治中，而不是用在开发好的软件上。 8、部署前5分钟才开始测试。
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