免疫组化初探

2019年1月13，星期天，晴
昨天是星期六，早上睡了一个懒觉，然后去丈母娘家看小孩子。中午匆匆吃了个饭，就去了实验室。按照原定计划，今天要完成免疫组化的第一次操作（主要是熟悉流程和探索抗体浓度）。
在这个之前把这个免疫组化的实验步骤详细的看了两遍，并在关键的地方进行了注释，然后开始准备各项试剂。
一、烤片。选好目标切片（高分化、中分化、低分化肿瘤组织和正常组织），然后放进65度烤箱里面。
按要求至少需要烤二个小时，在这期间去看一下细胞大哥的生长情况，510细胞状态还是比较喜人的，几乎没有什么黑点，而140细胞着实让我失望了——里面黑色的点点越来越多。昨天我用PBS还认真清洗了，已经没有了，当时中心实验室的WB学长看了一下，还说这个细胞状态已经很好了的！不想今天又是恢复老样子，我不信那个邪，再次给140细胞认真地用PBS洗了，期待以后有所改善。就在洗完细胞加完培养液，我再次在显微镜下看了一下细胞，发现培养瓶上面还留有很多的渣渣，那么我就在想，问题会不会是培养液上？所以说我把培养液放在一个3cm的培养板进行培养了。

二、二甲苯脱蜡,梯度酒精脱水:
二甲苯I 20min -- 二甲苯II 20 min—无水乙醇I 15min –无水乙醇II 15min -- 95%乙醇10min-- 80%乙醇10min-- 70%乙醇10min –双蒸水清洗10min

三、阻断灭活内源性过氧化物酶:
3%H2O2 37℃孵育10min,PBS冲洗3X5min;
四、抗原修复:
置0.01M枸橼酸缓冲液(PH 6.0)中用煮沸(95℃,15-20min),自然冷却20min 以上,至室温,PBS冲洗3X5min。
五、滴加适当比例稀释的一抗4℃冰箱孵育过夜或37℃孵育2—3小时,PBS冲洗3X5min(用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照);
六、试剂盒中的增强剂（A），15min，PBS冲洗3X5min。
七、滴加试剂盒中的二抗（B）, 37℃孵育15min, PBS冲洗3X5min;
八、DAB显色:1ml双蒸水先加一滴A,混合均匀,再加B和C,再次混匀,三夜混合后。室温反应2—10min,显微镜下观察,有棕黄色沉淀物,即自来水冲洗,终止反应。
九、苏木素复染3—5min,盐酸酒精分化1—2s,返蓝。
十、常规脱水,透明,干燥,封片。