Cell | 大规模平行测量抗原肽序列、TCR序列和单细胞转录组
原创 风不止步 图灵基因 2022-12-28 10:11 发表于江苏
收录于合集#前沿分子生物学技术
撰文：风不止步
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亮点：
一个模块化的、基于慢病毒的显示和递送平台能够对配体与受体的相互作用进行解码，进行受体特异性基因货物递送，并绘制受体特异性和单细胞状态图。
l ENTER显示配体，传递有效载荷，并记录受体特异性；
l ENTER可以使抗原特异性扩增或耗尽T或B细胞；
l ENTER-seq绘制单细胞中TCR特异性、克隆性和细胞状态；
l 患者样本的ENTER-seq解码了抗病毒T细胞记忆。
2022年12月13日，美国斯坦福大学的Howard Y. Chang博士等人在《Cell》上发表了一篇“Engineered cell entry links receptor biology with single-cell genomics”的文章，文章描述了慢病毒通过工程受体-配体相互作用（ENTER）介导的细胞进入，以显示配体蛋白，传递有效载荷，并记录受体特异性。优化ENTER，以解码T细胞受体（TCR）-MHC肽、抗体-抗原和其他受体-配体对之间的相互作用。病毒呈现策略使ENTER能够捕获B细胞受体和任何抗原之间的相互作用。
细胞通过配体-受体的相互作用相互沟通。例如，T细胞表面的T细胞受体（TCRs）可以识别并与抗原呈递细胞（APCs）表面的肽-主要组织相容性复合体（pMHC）相互作用。TCR和B细胞受体（BCR）的基因经过体细胞重组，可以识别无数的抗原。已经开发了许多方法来破译TCR的抗原特异性，包括以下方法：(1) 使用人工APC的细胞报告试验，(2) 酵母展示平台，(3) 基于T细胞的试验，和(4) DNA编码的pMHC四聚体。尽管每种技术都有独特的优势，但在临床样本中快速筛选pMHCs的初级T细胞，并以高通量的方式同时捕捉单个T细胞的抗原景观、TCR重排和转录组，仍然是一个挑战。类似的挑战也适用于研究BCR抗原相互作用。最近一种使用pMHC呈现的纳米粒子使mRNA在抗原特异性T细胞中传递，以进行瞬时调控。另一项研究使用pMHC假型病毒允许对抗原特异性T细胞进行遗传修饰。然而，除了T细胞之外，仍然缺乏选择性地操纵抗原特异性B细胞的技术。
图1：一个在病毒表面显示配体蛋白和融合原的平台，传递荧光蛋白，并通过细胞进入记录配体与受体的相互作用。
作者开发了一个模块化的病毒显示和传递平台，以解码配体-受体的相互作用，在目标细胞中传递载体，并将配体-受体的相互作用与细胞状态联系起来。将这种技术称为慢病毒介导的细胞进入，即通过工程化的受体-配体相互作用（ENTER），它可以系统地将成对的相互作用去孤化，包括TCRpMHC、抗体-抗原、成本刺激配体-受体和B细胞抗原-BCR。ENTER允许以受体特异性的方式传递基因，允许在抗原特异性T和B细胞中进行选择性调节。进一步将ENTER与基于液滴的单细胞基因组学分析（ENTER by RNA sequencing [ENTER-seq]）结合起来，测量抗原特异性、TCR重排、基因表达和单个人类初级T细胞的表面蛋白结构。
图2：ENTER解码pMHC与TCR之间的相互作用
用于配体显示、运送和互动记录的多面病毒平台
与收集多种单一用途的技术相比，ENTER为用户提供了一个能解决许多重要问题的平台。与解码TCR特异性的平台相比，ENTER具有优势。酵母/噬菌体展示平台的糖基化模式和蛋白质折叠与哺乳动物系统不同，这可能会干扰成对TCR的正确MHC呈现和识别。ENTER是在人类细胞中构建的，并能实现人类糖基化和蛋白质折叠模式。此外，在酵母/噬菌体展示平台上筛选时需要可溶性重组TCR，从而使平行测试不同的TCR成为挑战。相比之下，ENTER允许用户筛查临床样本，为检查人类TCR的巨大多样性打开了大门。ENTER也比T细胞报告试验有优势，因为后者不能在单细胞水平上记录pMHCTCR的配对情况。ENTER可以被设计成有针对性的传递，用户可以选择瞬时或稳定地传递，并可灵活使用整合缺陷颗粒。与现有的AAV等方式相比，ENTER可能在基因治疗或RNA医学方面有应用，因为ENTER可以实现精致的细胞类型特异性。
图3：ENTER-seq用于大规模平行测量抗原肽序列、TCR序列和转录组。
在单细胞分辨率下将配体-受体相互作用与分子蓝图联系起来
ENTER-seq将配体-受体相互作用与单细胞中的细胞状态大规模地联系起来。pMHC的ENTER-seq在概念上类似于DNA编码的pMHC四聚体，但有几个潜在的优势。ENTER比商业的DNA编码的pMHC四聚体更经济，并且可以在任何实验室中轻松实现。ENTER-seq库利用慢病毒生物学，确保每个病毒颗粒有2份编码的病毒RNA，允许对pMHC结合强度进行量化，这在使用DNA编码的pMHC四聚体的研究中还没有被探讨过。数据显示，高度扩增的TCR克隆与较高的pMHC结合有关，这可能是由于TCR与pMHC的亲和力较高或扩增克隆中的TCR密度较高。最后，ENTER比pMHC四聚体更敏感。这种优越的敏感性可能来自于显示配体的高价位。基于HIV的慢病毒颗粒显示14-100个分子的包膜蛋白，而pMHC四聚体是4个连接分子。肽刺激之前和之后的T细胞的ENTER-seq揭示了细胞扩增时的状态转换和对同一抗原反应的克隆间表型多样性。这种转变和Th2细胞因子表达的克隆差异可能受到对同一pMHC抗原的不同TCR亲和力/硬度/密度或不同APC引物环境的影响。总的来说，ENTER-seq允许研究者记录配体-受体的特异性，并读出这种相互作用的生物学后果。
图4：ENTER允许在抗原特异性T或B细胞中传递货物
ENTER技术在免疫学及其他领域的转化应用
ENTER可用于筛选免疫原性抗原或精英TCR，以合理设计疫苗开发或癌症免疫疗法。ENTER也可用于筛选针对病毒抗原的BCR，促进治疗性抗体的开发。最后，ENTER可以在抗原特异性T细胞和B细胞中定向传递基因载荷，这可能被用于重振耗尽的抗肿瘤T细胞，而不触发免疫相关的不良事件，或者用于消耗自体活性T或B细胞以治疗自身免疫。如果ENTER被扩展到更多的受体-配体对，如G-蛋白偶联受体、粘附分子或原粘连蛋白，它可能被用来解决免疫系统以外的细胞-细胞连接。
总之，ENTER将pMHC呈现为一个单链，任何需要的肽都与MHC共价连接。这种呈现方式并不反映选择和加载MHC上最佳肽的内源性抗原呈现途径。通过计算预测多肽与MHC的结合亲和力，并通过质谱鉴定MHC结合的多肽，将有助于优先选择最佳的多肽来生成pMHC显示的ENTER病毒。原则上，ENTER可以显示任何肽类抗原，以解码来自初级T细胞的大量pMHC-TCR相互作用。在未来，需要实现ENTER克隆、转染和可扩展的慢病毒包装策略的自动化，以提高产量。未来在提高病毒滴度和配体显示病毒的集合生成方面的工作将大大扩展筛选规模，以发现未知的配体-受体相互作用。在ENTER上显示的最大蛋白质配体是120kDa（截短的HER2），需要更大的配体测试。将病毒设计成整合缺陷和配体显示的病毒样颗粒（VLPs），用于ENTER-seq，因此不能通过传统的感染倍数对其进行量化。汇集的VLP定量可以通过病毒RNA-seq来实现对含有配体的读数进行定量。最后，抗原特异性基因递送到编辑免疫受体重构中还没有在原代细胞中实现，这可能是这项技术的一个富有成效的应用。
教授介绍
Howard Y. Chang博士
基因组科学训练的医生科学家。研究重点是协调细胞命运控制中大量基因活动的机制。介绍了长非编码RNA在生物调控中的重要和普遍的作用。在表观遗传学和RNA生物学方面有丰富的经验，包括发明了表观遗传学分析的新方法，绘制了RNA在染色质上的占有率，并在全基因组范围内定义RNA结构。开创了识别大规模转录程序的关键调节器的方法；这些方法在发育、癌症和衰老的研究中取得了丰硕成果。实验室的长期目标是破译人类基因组中的调控信息，用于疾病诊断和治疗。
参考文献
Bingfei Yu, Quanming Shi et al. Engineered cell entry links receptor biology with single-cell genomics.(2022)