Fc融合Pr。使用原核细胞表达-test1

2.2.2
Fc融合Pr。使用原核细胞表达
原核表达系统，特别是大肠杆菌系统
广泛用于一般重组蛋白的表达
实验室和工业环境。当然与其他表达系统相比，

大肠杆菌提供了一种快速且更经济的方法，易于扩大规模
生产高质量的治疗性蛋白质。然而，缺乏后期
翻译修饰机制（即糖基化）和形成正确的能力
二硫键存在其他挑战并限制了其在治疗中的应用
生产某些蛋白质。事实上，大肠杆菌的制造过程
涉及细菌发酵，需要大量的下游加工
例如重折叠步骤和半胱氨酸二硫化物的形成，可能需要几个
柱色谱步骤（见第 4 章）。尽管有潜在的故障排除
通过下游再折叠，细菌系统可以产生高总产量和
适合商业制造的质量。例如，第一个大肠杆菌
表达疗法于 1982 年被 FDA 批准用于人胰岛素
治疗糖尿病 [42] 以及今天超过 150 种重组蛋白
在已获准用于临床的药物中，近 30% 是在大肠杆菌中产生的 [43]。
因此，原核系统可能是生产更小的 Fc 融合蛋白的理想选择
其中不需要糖基化的 Fc 区。
肽体或肽-Fc融合是Fc融合的一种新型治疗形式
并且在某些情况下可以在大肠杆菌中制成。肽体具有生物活性
框内移植到 Fc 结构域上的肽。Romiplostim (Nplate 1) 是
获得 FDA 和欧洲批准用于人类的一流肽体。
Romiplostim 由一个人 IgG1 Fc 区和一组 C 端融合的
两种血小板生成素模拟肽[44]。Romiplostim是另一种治疗方法
医生可用于免疫性血小板减少性紫癜 (ITP) 的治疗方式。这
这种方式有几个独特的优势，因为形成
通过 Fc 二硫化物的同源二聚体导致由
两个 Fc 区的二聚化。与单独的肽不同，后者遭受快速
肾清除率 [45] 并且不能参与保护性新生儿 Fc 受体 (FcRn)
为了循环回细胞表面，Fc融合可以表现出更长的血浆
驻留时间。其他肽体正在进行临床试验，例如 AMG 386
(trebananib) 和 AMG 819，它们在大肠杆菌中同样表达。有
其他新型肽体 Fc 融合体，如 Epo-IgG [46] 和 CoVx 体 CVX-60
[47]。虽然两者都已在 CHO 细胞中表达并处于临床评估中，
也有报道称正在开发低成本的植物表达系统
用于 Epo-Fc 融合 [48]。

2.2.2.1 向量
许多大肠杆菌表达载体已被建立用于大型商业用途
规模发酵。大肠杆菌表达载体通常带有启动子
在一个调控基因的控制下，该基因可以是载体的一部分或整合到
宿主细胞[49]。核糖体结合位点位于下游
启动子，Shine-Dalgarno 序列有助于将核糖体募集到 mRNA 上
翻译起始[50]。在 3 0 末端包含一个转录终止子
感兴趣的基因确保正确的转录终止。大肠杆菌表达
载体还携带适当的来源复制以控制基因剂量。
pUC等高拷贝质粒可产生500-700的拷贝数
而较低拷贝数的质粒如 pBR322 产生 15 到 20
副本 [43,51]。虽然高拷贝数质粒通常会导致更高的基因
剂量和更高的蛋白质产量，它也可能导致有毒物质的积累
蛋白质，并且由于代谢压力而对生产力产生不利影响
[49]。此外，在大肠杆菌中保持高拷贝数通常需要使用
用于维持不适合大规模应用的选择压力的抗生素
治疗性蛋白质生产，因为担心会引起过敏反应
患者 [43] 和增加的生产成本以及对任何潜在
下游对环境的影响。
原核载体还可以通过使用
诱导型启动子通过正调节或通过阻遏蛋白 [52]。

使用具有低基础表达水平的强启动子设计载体
非诱导状态对蛋白质表达至关重要。增长中的泄漏表达
阶段可能导致重组蛋白的早期积累并导致代谢
负担。使用不同的启动子也对应不同的诱导
方法，应具有成本效益且易于操作。lac、tac 和 trc
启动子通常用于基础研究。这些启动子是泄漏的，并且
由异丙基-b-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 诱导。噬菌体 T7 启动子
是另一种常用的可由 IPTG 诱导的高表达启动子。
虽然 IPTG 诱导通常用于研究环境，但其毒性和
对于大规模制造治疗剂来说，高成本是不可取的。其他
诸如温度或代谢控制等诱导方法已经
与不同类型的发起人一起发展。噬菌体lamda pL
是一种广泛用于大规模蛋白质生产的温度调节启动子。这
碱性磷酸酶 phoA 启动子由磷酸盐饥饿诱导。卡达
启动子受 pH 变化控制，可用于有限数量的载体
[43,49]。在原核生物中发现缺乏翻译后修饰
表达系统在某些方面由极其灵活的各种
表达系统和相对便宜的制造成本。虽然它是
难以修改已批准疗法的现有制造协议，新的
大肠杆菌系统，例如基于 T7 的启动子（例如 pLysS1）可能允许更少
担心未来生产中是否需要使用IPTG等因素
来自大肠杆菌的新治疗蛋白的临床材料。