任何基因编辑工具都绕不开脱靶效应，因此开发简便，高效的脱靶位点检测方法，对于评估和利用各种基因编辑工具尤为重要。目前已经发展出了一系列的体外（in vitro）和体内（in vivo）的检测方法。今天我们分享用于CRISPR/Cas9 体外检测脱靶位点的几种方法。
1.Digenome-seq与DIG-seq
Digenome-seq（Digested genome sequencing）[1, 2]，提取基因组 DNA后在体外进行CRISPR/Cas9的切割，然后对切割DNA进行高通量测序，鉴定脱靶位点。DIG-seq[3]则使用分离到的染色质DNA（结合有组蛋白的基因组DNA，更接近细胞内DNA的状态）进行体外核酸酶切割与高通量测序，发现染色质DNA相比基因组DNA，脱靶效应有所降低。这种方法是基于全基因组测序，需要很高的覆盖度才能达到比较好的检测效果。
2.CIRCLE-seq & CHANGE-seq
CIRCLE-seq[4, 5]是将提取的 基因组DNA片段化后环化，在体外进行CRISPR/Cas9的切割，被靶向（包括On-target和Off-target）的DNA会被切割成线性，再对线性的 DNA 加接头建库和高通量测序，起到富集靶向DNA的效果。因此，相比于 Digenome-seq，CIRCLE-seq是一种更为灵敏的细胞外检测方法。
CHANGE-seq[8]也是开发CIRCLE-seq的课题组在CIRCLE-seq基础上改进而来的。其主要改进包括：使用Tn5转座酶DNA片段化与接头插入。
3.SITE-seq
SITE-seq[6]在体外使用CRISPR/Cas9切割完整基因组DNA后，在切割位点链上带生物素标记的接头，经过进一步的DNA片段化后，利用生物素标记富集被切割DNA片段，经过进一步文库构建和高通量测序后即可鉴定到切割位点。该方法也采取了富集切割位点片段的方式进行脱靶情况的分析。
4. SEMA-seq
评估CRISPR/Cas9不一定要用基因组DNA。SEMA-seq[7]则是采用体外合成的SELEX 文库，进行体外DNA片段的切割和高通量测序鉴定。这种方法可以用于评估CRISPR系统的结合特异性（例如PAM序列的分析）和切割特异性。
Reference
1. Kim, D., et al.,Digenome-seq: genome-wide profiling of CRISPR-Cas9 off-target effects in human cells.Nature methods, 2015.12(3).
2. Kim, D., B.-C. Kang,and J.-S. Kim,Identifying genome-wide off-target sites of CRISPR RNA-guided nucleases and deaminases with
Digenome-seq.Nature protocols, 2021.16(2):p. 1170-1192.
3. Kim, D. and J.-S.Kim,DIG-seq: a genome-wide CRISPR off-target profiling method using chromatin DNA.Genome research, 2018.28(12): p. 1894-1900.
4. Tsai, S.Q., et al.,CIRCLE-seq: a highly sensitive in vitro screen for genome-wide CRISPR-Cas9 nuclease off-targets.Nat Methods, 2017.14(6): p. 607-614.
5. Lazzarotto, C.R., etal.,Defining CRISPR-Cas9 genome-wide nuclease activities with CIRCLE-seq.Nature protocols, 2018.13(11): p. 2615-2642.
6. Cameron, P., et al.,Mapping the genomic landscape of CRISPR-Cas9 cleavage.Nature methods, 2017.14(6): p. 600-606.
7. Zhang, L., et al.,Systematic in vitro profiling of off-target affinity, cleavage and efficiency for CRISPR enzymes.Nucleic acidsresearch, 2020.48(9): p. 5037-5053.
8. Lazzarotto, C. R. et al. CHANGE-seq reveals genetic and epigenetic effects on CRISPR-Cas9 genome-wide activity. Nat Biotechnol 38, 1317-1327 (2020).