10X单细胞联合空间转录组技术解析结直肠癌肿瘤微环境

作者，追风少年i

周五了，一周马上过去了，感觉如何？？？ 和很多人交流，发现一个很有意思的现象，每个人都盯着自己没有的东西，自己拥有的都选择忽视，这样的态度，是不是我们烦恼的根源？？

好了，继续我们单细胞空间的研究内容，今天分享的文章在Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages in colorectal cancer, 2022年4月发表于NC，上海交通大学医学院上海市免疫学研究所苏冰教授团队和叶幼琼研究员团队发表，国内的学术性论文，值得分享一下。

结直肠癌 (CRC) 是第三大最常见的恶性肿瘤（仅次于肺癌和乳腺癌），每年在全世界造成约 800,000 人死亡。最近，继在黑色素瘤和肺癌等先前难以治疗的实体瘤中取得成功后，免疫检查点阻断 (ICB) 策略被应用于 CRC 治疗。已经有许多研究探索 T 细胞用于有效的抗肿瘤免疫疗法。然而，靶向 PD-1 的抗体 pembrolizumab 仅对具有高度微卫星不稳定性 (MSI-H) 的错配修复缺陷型肿瘤有效，占转移性 CRC 病例的 5% 以下。因此，有必要了解结直肠癌肿瘤微环境（TME）中细胞和分子重塑的机制，寻找潜在的干预靶点以提高免疫治疗的疗效。最近的研究表明，基质细胞和骨髓细胞可能为肿瘤的生长和转移形成独特的生态位，使其成为潜在的治疗靶点。

间充质基质细胞是组织重塑、炎症反应、上皮细胞生长和免疫抑制所必需的非上皮、非造血细胞成分。虽然缺乏典型的谱系标记，但它们对波形蛋白、胶原蛋白、PDGFRα/β 和 podoplanin 呈阳性，在组织和细胞类型中具有不同的分布模式。单细胞转录组学的最新进展使细胞群的系统分析能够以前所未有的分辨率解决结直肠疾病，包括炎症性肠病和 CRC。不同的基质细胞群可能在 IBD 发展中发挥独特的作用。例如，据报道，一个基质细胞群位于隐窝生态位中，具有正常的修复和再生反应功能，而另一个基质细胞群具有促进疾病严重程度的促炎特征。此外，表达 IL13RA2 和 IL11 的炎性成纤维细胞与 IBD 患者对抗 TNF 治疗的抵抗有关。基质细胞的异质性也被认为与 CRC 进展的结果有关。两组成纤维细胞，包括肌成纤维细胞和癌症相关成纤维细胞，已被鉴定并发现优先富集在 CRC 肿瘤中。此外，肌成纤维细胞相关基因特征也被确定为 CRC 共有分子亚型 4 的主要特征之一，其由肿瘤基质的富集和 TGF-β 信号介导的细胞外基质重塑定义。新出现的证据表明，肿瘤肌成纤维细胞可能是肿瘤驱动的基质群。然而，由于上述研究中使用的基质细胞仅代表总测序群体的一小部分，这阻碍了他们以高分辨率进行深入研究，因此迫切需要了解基质亚型的确定功能，尤其是关于与 TME 中其他细胞的串扰。在这方面，单细胞 RNA 测序 (scRNA-seq) 揭示了细胞串扰在多种癌症中的重要性，并确定了内皮细胞与巨噬细胞和肿瘤特异性角质形成细胞与 TME 内其他类型细胞的相互作用。

最近有报道称，从 TME 中排除浸润性免疫细胞与 CRC 患者的不良预后相关，并且已建议定位于肿瘤边缘的肿瘤相关巨噬细胞 (TAM) 可防止细胞毒性淋巴细胞 (CTL) 浸润肿瘤核心。据报道，两种类型的 TAMs 具有不同的炎症和血管生成特征，并且对 CSF1R 阻断治疗的反应相反。其他研究还报道了表达 M2 巨噬细胞标志物（例如，CD163、DC-SIGN）的巨噬细胞或表达 FSP1、FAP 的癌症相关成纤维细胞与 CRC 患者的不良预后之间呈正相关。最近报道了一种具有独特特征的 TAM 亚型，称为 SPP1+ 巨噬细胞，具有免疫抑制特性，并与 EMT 标志物呈正相关，可作为抗肿瘤生长和转移的潜在靶标。然而，尚未充分研究 CRC TME 中骨髓细胞与其他类型细胞之间的相互作用。

在文章的研究中，研究团队利用单细胞转录组测序方法发现与癌旁组织相比，结直肠癌组织特异性富集FAP+ fibroblasts及SPP1+ macrophages，并通过CIBERSORTx对多个结肠癌数据集分析发现这两种细胞浸润程度高度相关。团队进一步使用空间转录组发现存在同时表达这两种细胞特征基因的聚类，这一聚类的空间位置和细胞外基质的形成高度相关，提示FAP+ fibroblasts和SPP1+ macrophages在肠癌中的空间定位上也接近，并围绕肿瘤中心形成“墙壁”样的肿瘤边界。

试验设计

• 研究入组样本及方法
• 5名非转移性结直肠癌患者：手术获取肿瘤样本和邻近正常组织，经质控后共获得54103个细胞的单细胞转录组测序数据用于后续分析；
• 上述5例中的4例患者：肿瘤组织切片进行空间转录组学分析；
• 另外整合了公共数据库信息：GEO结直肠癌间充质基质细胞单细胞转录组学数据、TCGA-COAD队列数据、IMvigor210公共数据集。

文章研究设计概览

研究成果

绘制结直肠癌肿瘤组织及配对正常组织的单细胞转录组图谱

基于5例结直肠癌患者的肿瘤组织及癌旁正常组织（结肠腺癌（COAD）2例，直肠腺癌（READ）3例），获取单细胞并进行单细胞转录组测序。经过数据处理及聚类分析注释，这些细胞被分为九种主要细胞类型，包括上皮细胞（表达EPCAM和CDH1）、T/ILCs细胞（表达CD3E和CD3G）、B细胞（表达MS4A1和CD79A）、浆细胞（表达SDC1和MZB1）、髓样细胞（表达CD14和FCGR3A）、肥大细胞（表达KIT、IL1RL1和MS4A2）、内皮细胞（EC，表达PECAM1和CDH5）、间充质基质细胞（MSCs，表达COL1A1和COL3A1）及神经胶质细胞（表达S100B和CDH2）。尽管5例患者的肿瘤和邻近正常组织中均出现了所有九种主要细胞类型，但每种主要细胞类型的浸润程度不同，反映了结直肠癌进展阶段的差异（这些marker需要总结一下）。

单细胞转录图谱

CRC患者肿瘤组织中的细胞亚群特征揭示肿瘤微环境特征且可以预测临床结局

文章深入研究了这些细胞亚群相关调控通路基因的表达情况。采用Molecular Signatures Database (MsigDB) 数据库中的hallmark基因集来分析肿瘤组织和邻近正常组织之间MSC、ECs、胶质细胞、髓样细胞、T细胞和B细胞通路的变化。与正常组织相比，肿瘤组织中的免疫相关途径，包括炎症反应、IL2/STAT5信号和IL6/JAK/STAT3信号，不仅在免疫细胞群（如髓系细胞和T/ILC细胞）中富集， 在MSC和ECs在肿瘤组织中也富集，提示MSCs和ECs也参与抵抗结直肠癌的免疫反应。与正常样本相比，肿瘤的MSC、ECs和髓系细胞中缺氧的标志基因集更丰富。这些特征可能反映了肿瘤缺氧区域基质细胞的相互作用，将巨噬细胞、MSC和ECs连接起来，重塑CRC微环境。此外，文章结合TCGA-COAD、TCGA-READ以及GEO数据库中的12个CRC队列的scRNA-seq数据，计算免疫细胞浸润情况，并进行细胞之间的相关性分析及临床结局分析。结果显示MSC和髓系细胞之间显著正相关，并且MSC浸润程度较高的CRC患者与较差的OS和PFS相关，髓系细胞浸润程度高与较差的OS和PFS相关（关于单细胞空间与临床方面的研究其实是单细胞空间技术走向临川运用的契机）。

骨髓间充质基质细胞和髓系细胞在肿瘤浸润中呈正相关，并与临床结果相关

肿瘤特异性FAP+ 成纤维细胞与结直肠癌进展相关

一直以来，MSCs和成纤维细胞样细胞一直被认为是调节肿瘤发生和癌症进展的关键基质细胞类型，结合上述发现的MSCs与预后的关系，文章利用之前报道的特定细胞特征标记将MSC分为10个亚型，分析比较肿瘤和相邻正常组织之间MSC亚型的浸润差异。结果显示FAP+成纤维细胞、增殖成纤维细胞和周细胞在肿瘤组织中明显富集，而NT5E+ 成纤维细胞、FGFR2+成纤维细胞、ICAM1− 端细胞和MFAP5+ 肌成纤维细胞在肿瘤邻近的正常组织中富集。在肿瘤和肿瘤周围正常组织之间，CD24+ 成纤维细胞、DES+ 成纤维细胞和ICAM1+ 终末细胞没有显著差异。这种差异趋势通过TCGA数据得到验证，文章还通过流式实验的方法验证了肿瘤特异性成纤维细胞浸润差异。

接下来作者基于单细胞数据，分析推断FAP+ 成纤维细胞的分化轨迹。分析预测肿瘤特异性FAP+ 成纤维细胞可能起源于FGFR2+ 成纤维细胞或ICAM1+ 终末细胞，并且TWIST1在FAP+ 成纤维细胞的调节网络中具有最高的表达和活性水平，可能代表驱动该分化途径的主要转录因子。

正常粘膜和肿瘤组织中基质细胞的特征

肿瘤特异性SPP1+ 巨噬细胞与CRC进展相关

文章第一部分的差异分析结果除了成纤维细胞，还有髓系细胞。在髓系细胞的深入研究中，主要细分了9种亚型，各有特定的表达标志物。分析比较肿瘤和相邻正常组织之间髓系细胞亚型的差异浸润，发现巨噬细胞和中性粒细胞主要存在于肿瘤组织中，而DC在相邻正常组织中富集。重要的是，SPP1+ 巨噬细胞是肿瘤特异性巨噬细胞，占肿瘤样本中髓系细胞的11.6%，但仅占相邻正常组织中髓样细胞的0.68%，同样，差异结果通过TCGA数据以及流式实验得到验证。在TCGA和GSE17536 CRC队列中，SSP1+巨噬细胞高浸润患者具有更短的PFS。分化轨迹结果表明肿瘤特异性SPP1+ 巨噬细胞可能起源于THBS1+ 巨噬细胞。调节因子分析结果表示SPP1+ 巨噬细胞也可能受到HIF-1信号通路的调节。

由于FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞与缺氧诱导的通路密切相关，研究人员推测在肿瘤的缺氧区域可能存在一个基质细胞介导的网络，该网络将巨噬细胞和MSC连接起来，共同促进CRC微环境的恶化。

正常粘膜和肿瘤组织中髓样细胞的特征

FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞的高浸润与较差的患者生存率相关且空间转录组学显示两者之间存在相互作用

作者利用CIBERSORTx在14个独立的CRC队列中分析scRNA-seq鉴定到的58个细胞类型的浸润状态，结果验证FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞相关性最高。在FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞不同浸润水平的患者中，二者浸润均较高的患者(FAP+High_SPP1+High)PFS最短，表明这两种细胞类型可以协同促进肿瘤进展。蛋白及免疫组化数据分析显示肿瘤组织中FAP和SPP1的表达均特异性增加，且FAP或SPP1蛋白水平高的患者的OS较短。免疫荧光标记显示CRC组织中SPP1阳性和FAP阳性细胞在空间上非常接近，提示二者之间可能存在串扰。利用空间转录组技术对两种细胞进行更深层次的挖掘分析，结果显示大多数FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞共定位，并包裹恶性上皮细胞，T细胞和B细胞被排斥在肿瘤区域以外。FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞中促结缔组织增生结构形成的途径高度活跃，包括细胞外基质组织、胶原纤维组织和对TGF-β的反应。这些现象表明这两种类型细胞之间可能存在物理相互作用，并可能调节促结缔组织增生的微环境以限制免疫细胞浸润至肿瘤核心。

FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞的临床预后作用

空间互作（NicheNet）

FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞的相互作用可能有助于促结缔组织增生性肿瘤微环境的形成

为了验证上述的猜测，确定CRC患者中FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞相互作用的关键介质，文章研究了FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞的细胞-细胞通讯机制。FAP+ 成纤维细胞通过TGF-β超家族基因，TGFB1和INHBA的表达增强SPP1+ 巨噬细胞的促炎活性，TGF-β诱导SPP1+ 巨噬细胞中ACVRL1、ACVR1或ACVR1B的表达。FAP+ 成纤维细胞通过WNT5A-FZD2和CCL3-CCR5增强SPP1+ 巨噬细胞的招募，并可能作为一个驱动因素通过趋化素促进SPP1+ 巨噬细胞分化。SPP1+ 巨噬细胞表达细胞因子TGFB1、IL1A和IL1B, 可与FAP+成纤维细胞表达的受体结合，促使多种编码胶原和基质金属蛋白酶基因靶点的表达，这些靶点是促结缔组织增生反应的重要组成部分，其中大部分参与ECM通路。综上，FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞形成一个相互作用的网络，支持彼此的维持和功能。这两种细胞类型可能在ECM重塑中发挥重要作用，可能促进TME促纤维增生区的形成。

FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞之间的相互作用网络

FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞的高浸润与免疫治疗耐药相关

文章最后分析了具有不同FAP+ 成纤维细胞和/或SPP1+ 巨噬细胞浸润模式的肿瘤的局部免疫特征。FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞浸润度高的肿瘤样本表现相对高比例的非同义突变和单核苷酸变异（SNV）预测的新生抗原，并且具有较高的香农熵指数和TCR丰富度，说明T细胞对新抗原的无效反应。在所有CRC亚型中，该亚型的淋巴细胞浸润最低，表明该特定类型肿瘤的微环境特征是免疫排斥型的。采用IMvigor210公共数据集分析预后相关性发现，FAP或SPP1表达水平高的患者以及FAP和SPP1表达都高的患者具有更短的OS。相比FAP和SPP1低表达的患者， FAP或SPP1高表达的患者表现出较低的应答，和更多的疾病进展（PD），这表明FAP或SPP1高表达的患者对抗PD-L1治疗的应答明显低于其他患者。

FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞影响淋巴细胞浸润并与免疫治疗疗效相关

discussion

通过整合分析scRNA-seq数据、公开发表的scRNA-seq和bulk RNA-seq数据集、空间转录组数据、FACS、IF和免疫治疗的转录组数据，本研究提供了单细胞分辨率下的配对的肿瘤和癌旁正常组织综合的TME景观图，证实FAP+ 成纤维细胞和SPP1+ 巨噬细胞的相互作用参与形成促结缔组织增生性TME，阻止淋巴细胞浸润，可能导致肿瘤免疫治疗抵抗，可以作为CRC治疗的潜在靶点。

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