single cell dna note

第一：mapping record

https://www.biostars.org/p/138116/

maping num 大于 reads num

18839435 – 146997 = 18692438 #clean_read

18726872 – 146997 = 18579875 #exclude segmentunmapped and secondary alignment

即samtools flagstat 统计中的得到的mapping read 包含secondary alignment and supplementary，因此可能大于read num

samtools flagstat mapped = pysam.mapped

第二：比对

samtools view -F 256（过滤掉secondary alignment）

samtools view  -F 2048 （过滤掉supplementary alignment）

1、-M与-Y比较

bwa mem -M -K 100000000 -t 10 -R @RG\tID:havem\tSM:havem\tPL:illumina\tPU:illumina\tLB:illumina ref fq1 fq2 > sam

bwa mem -Y -K 100000000 -t 10 -R @RG\tID:havem\tSM:havem\tPL:illumina\tPU:illumina\tLB:illumina ref fq1 fq2 > sam

bwa mem 与bwa mem -Y 结果一致 呈现于samtools flagstat 中的 146997 + 0 supplementary

bwa mem -M 与 bwa mem -M -Y 结果一致 呈现于samtools flagstat 中的 146997 + 0 secondary

2、bwa mem -M

3、bwa mem -Y

bwa mem -p 忽略输入中的reads2，如果双端reads PE比对，如果加上-p 则bam文件中相同reads只有一条记录（reads1）

4、bwa mem -K 

https://gatkforums.broadinstitute.org/gatk/discussion/11554/bwa-parameters-in-gatk4-data-processing-workflow

默认情况下，bwa-mem会将一批reads操作加载到RAM中进行处理。加载的基数的数量与线程的数量成比例，因此使用不同数量的线程可能会产生稍微不同的映射结果。K参数要求工具将固定数量的碱基加载到RAM中，从而实现可再现性。

第三：bam文件格式解释

1、术语和概念

链接：https://www.jianshu.com/p/8d01019f33f2

在学习SAM格式之前，请确认自己是否对如下概念有清楚的认识|

read: 测序仪返回的原始序列.一个read可以包括多个segment。read之间的先后顺序表示被测序仪读到的时间前后关系.

segment:  一段连续的序列或子序列

linear alignment: 线性联配表示一个read比对到单个参考序列，可以存在插入，缺失，跳过(skip),剪切(clip), 但是不存在方向改变的情况(比如说一部分和正向链联配，另一个位置则是和负向链联配）。最简单的判断的方式就是，一个linear alignment只用一行记录。

chimeric alignment: 嵌合联配需要多行记录。比如说r003第一个记录是后6个匹配，第二个记录则是反向序列的后5个匹配。第一个被称之为"representative",其他都是"supplementary"

read alignment: 无论是linear alignment, 还是chimeric alignment, 只要能完整表示一个read，都成为是read alignment

multiple mapping: 由于存在重复区，一个read 可能比对到参考基因组的不同区域。其中一个被认为是primary，其他都是secondary.

两个系统|1-based coordinate system（SAM,VCF,GFF,wiggle)和0-based coordinate system(BAM, BCFv2, BED, PSL).自行用R和Python感受一下两者的不同。

chimeric alignment 可能是结构变异，基因融合，参考序列误组装，RNA-Seq，实验protocol等因素造成。对于chimeric alignment的里面每一个linear alignment而言，由于相互之前不存在重叠，故而联配质量较高，适合用于SNP/INDEL calling.相反, multiple mapping则是因为重复造成(read越长出现的概率越低), 相互之间存在重叠，仅有其中一条有最优的匹配，其他联配质量过低会被SNP/INDEL caller忽略。