每周文献 2022-02-27

大家好，本周给大家分享的是最近发表在PNAS上与番茄含氮香气挥发物相关的一篇文章。

文章题目：A flavin-dependent monooxygenase produces nitrogenous tomato aroma volatiles using cysteine as a nitrogen source (一种黄素依赖的单加氧酶利用半胱氨酸作为氮源产生含氮的番茄香气挥发物)

期刊： Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS)

影响因子： 2020_IF = 11.205; 中科大类: 综合性期刊 1区; 中科小类: 综合性期刊 1区; JCR分区: Q1

发文单位：加拿大Vineland研究与创新中心、布鲁克大学等9家单位。

文章作者：加拿大Vineland研究与创新中心David K. Liscombe 为第一作者，加拿大拉瓦尔大学Charles Goulet 为通讯作者。

摘要：番茄在果实成熟过程中会产生多种挥发性化学物质，产生独特的香气，有助于形成整体风味。这些挥发物中有几种芳香族和脂肪族含氮化合物，其生物合成途径尚不清楚。虽然在番茄果实中这些含氮挥发物含量丰富，但它们在不同番茄枝的近缘种果实中的含量变化很大。比如绿果番茄潘那利番茄（S. pennellii）几乎检测不到，而红果栽培番茄（S. lycopersicum）和醋栗番茄（Solanum pimpinellifolium）含量相对较高。利用一个来自潘那利番茄的渐渗群体，作者确定了番茄果实中所有可检测到的含氮挥发物的产生所必需的位点。番茄转基因植株中潜在基因（SlTNH1；Solyc12g013690）的沉默消除了成熟果实中脂肪族和芳香族含氮挥发物的产生，对这些果实的代谢组学分析揭示了一种已知的半胱氨酸和3-甲基丁醛的结合物2-异丁基-四氢噻唑烷-4-羧酸的积累。在2-异丁基噻唑和2-苯乙腈中合成稳定同位素标记的前体，证实半胱氨酸为番茄果实中所有含氮挥发物提供氮原子。表达SlTNH1的烟草植株很容易将合成的2-取代四氢噻唑烷-4-羧酸底物转化为相应的2-取代肟、硝基和腈挥发物的混合物。与植物中其他已知的依赖黄素的单加氧酶不同，这种四氢三噻唑烷-4-羧酸N-羟化酶催化顺序羟基化。阐明这一途径是理解并最终改善番茄风味品质的重要一步。

主要结果：

1、产生含氮挥发性物质的必需基因

番茄果实会产生一些相对少见含氮挥发物，包括2-苯乙腈（苄基氰化物）、1-硝基-2-苯乙烷、3-甲基丁腈（异戊腈）、1-硝基-3-甲基丁烷和2-异丁基噻唑（图1A）。在一个潘那利IL群体（28）中筛选了影响成熟果实含氮挥发物合成的QTL。在这些品系中，相对于番茄亲本背景（M82），IL12-2、IL12-3-1和IL12-3表现出含氮挥发物的显著减少（图1B）。测量每个株系的挥发性图谱，以精细定位含氮挥发性QTL（图1C），最后将QTL定位到预测包含16个基因的100kb的区域。其中，Solyc12g013690注释为“单加氧酶FAD结合蛋白”，被认为是最佳候选基因。进一步分析发现Solyc12g013690转录水平在四个独立的转基因株系中显著降低（图2A）。与对照相比，四个株系的含氮挥发物都显著减少（图2B）。在转基因株系中，相关苯丙氨酸和亮氨酸衍生的醇和醛的含量没有受到影响，表明该基因主要影响含氮挥发物。

图1.jpg

图1. Chr12上的一个基因（Solyc12g013690）负责番茄果实中氮挥发物的生物合成。（A）番茄果实中主要氮挥发物的结构。（B）ILs和番茄亲本(M82)成熟果实的氮挥发物含量。（C）12号染色体上氮挥发相关QTL的精细定位。一组含氮挥发物含量低或高（野生型）的重组子来自M82和IL12-2之间的杂交。

图2.jpg

图2. 反义介导的Solyc12g013690（SlTNH1）沉默导致水果中含氮风味挥发物的显著减少。(A) 与对照相比，四个独立的转基因株系果实中的转录水平。（B）对照株系和转基因株系切开成熟果实检测到的含氮挥发物含量。

作者测量了番茄果实在不同阶段中2-苯乙腈、1-硝基-2-苯乙烷、3-甲基丁腈、1-硝基-3-甲基丁烷和2-异丁基噻唑的含量，以确定它们的积累是否也像许多其他风味挥发物一样与成熟过程有关。M82中的五种主要含氮挥发物在成熟前低于检测水平，但在成熟过程中显著增加（图3A）。定量PCR分析表明，Solyc12g013690在果实成熟初期表达升高，在完全成熟阶段达到最高水平（图3B），这与含氮挥发性物质的产生模式一致。绿熟期乙烯处理导致野生型（WT）果实中的Solyc12g013690表达增加。在乙烯不敏感突变体“Never-ripe”中，这种增加显著减弱（图3C）。用1-甲基环丙烯（1-MCP）处理成熟果实，可降低Solyc12g013690的表达（图3C），表明番茄果实中含氮挥发性物质的产生依赖于乙烯。

图3.jpg

图3. 番茄中与成熟相关的含氮挥发物积累和Solyc12g013690（SlTNH1）表达。(A) M82果实成熟过程中含氮挥发物的含量。（B）番茄M82叶片、花朵和整个果实成熟（未成熟、破色、转色和成熟期）中的Solyc12g013690转录水平。（C）对乙烯（ET）响应的Solyc12g013690转录水平。

2、基因沉默导致含硫底物的积累

非靶向超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-QTOF-MS）分析成熟果实，并比较Solyc12g013690沉默株系（图4C）与未沉默对照组的代谢物图谱，结果显示质谱特征，“5.40_190.0896m/z”，在反义株系中持续累积（图4B）。此外，与WT相比，分离的EMS诱导的终止密码子变异株系（W278）含有显著更高水平的这种代谢特征（图4B）。在研究中发现一种化合物是S-异丁基四氢噻唑烷-4-羧酸（IT4C）的环状类似物（图4A）。作者以L-半胱氨酸和3-甲基丁醛为原料合成了IT4C，并通过质子核磁共振对其结构进行了验证。通过UPLC-QTOF-MS分析，番茄果实的该质谱5.40_190.0896m/z特征的保留时间、准确质量和裂解方式与合成IT4C相匹配，确认这个代谢物的身份（图4C）。另外发现， IT4C可能是Solyc12g013690的底物，这意味着半胱氨酸是含氮挥发物的氮源。

图4.jpg

图4. SlTNH1活性受损导致番茄果实中2-异丁基四氢噻唑烷-4-羧酸（IT4C）的积累。(A) IT4C可以由L-半胱氨酸和3-甲基丁醛轻松合成。（B）UPLC-QTOF-MS的非靶向代谢组学显示，IT4C在SlTNH1反义株系和终止密码子变异中积累。(C) m/z 190.0902的萃取离子色谱图显示，SlTNH1反义株系中积累的代谢特征被明确确定为IT4C。

3、半胱氨酸为含氮挥发物提供氮原子和四氢噻唑烷N-羟化酶

为了研究氮原子在含氮挥发物生物合成中的来源，通过将稳定同位素标记的生物合成前体掺入 2-异丁基噻唑和 2-苯基乙腈中，该研究证实了半胱氨酸是番茄果实中所有含氮挥发物的氮来源。烟草叶片瞬时表达Solyc12g013690，2-苯乙醛衍生的四氢噻唑烷底物很容易转化为2-苯乙腈和1-硝基-2-苯乙烷（图5B），确定半胱氨酸是这些无硫代谢物中的活性氮源。重组SlTNH1与2-取代四氢噻唑烷底物（图5A和B）结合产生的挥发性图谱再现了番茄果实产生氮挥发性的生物合成能力，根据其催化顺式N-羟基化将该酶命名为四氢噻唑烷-羟基化酶(TNH)。

图5.jpg

图5. Solyc12g013690编码一种四氢噻唑烷N-羟化酶（TNH），并将2-四氢噻唑烷转化为含氮风味挥发物。(A)番茄果实中依赖TNH的氮挥发性生物合成模型。（B-C）含氮风味挥发物是通过瞬时表达SlTNH1，并补充由2-苯乙醛和L-半胱氨酸（B）以及3-甲基丁醛和L-半胱氨酸（C）制成的相应噻唑烷在烟草叶片中产生。

总之该研究证明，一种黄素-单加氧酶型酶TNH负责番茄中多种芳香族和脂肪族含氮挥发性化合物的生物合成，并利用自发形成的半胱氨酸结合物作为底物。这一发现定义了一条依赖半胱氨酸途径进入植物中的含氮挥发物，促使人们重新考虑硫代谢对番茄风味和品质的影响。

文中所有图片均来自A flavin-dependent monooxygenase produces nitrogenous tomato aroma volatiles using cysteine as a nitrogen source

文中有表述不当的地方，是我的问题，请在后台与小编联系修改，也可以自行阅读原文，谢谢理解与支持。如有团体或个人认为本文侵犯您的权利，请及时联系小编删除。

文章链接地址：https://www.pnas.org/content/119/7/e2118676119

参考文献：
Liscombe D K, Kamiyoshihara Y, Ghironzi J, et al. A flavin-dependent monooxygenase produces nitrogenous tomato aroma volatiles using cysteine as a nitrogen source[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2022, 119(7).