来源：http://www.detaibio.com/topics/jiao-mu-biao-da-yuan-li.html
酵母蛋白表达系统
本文主要讲述了毕赤酵母蛋白表达的原理，毕赤酵母表达能够高效表达的机制。
巴斯德毕赤酵母(以下简称毕赤酵母）能够高效表达外源基因，是因为其有更强的强启动子，即醇氧,FDF化酶启动子PAOX。甲醇营养型酵母能将甲醇分解为甲醛和过氧化氢，在此反应中参与的酶是醇氧化
酶(AOX1和AOX2)。其中，AOX2的表达量比AOX1低得多，以甲醇为唯—碳源时，AOX1增至细胞总蛋白的40%。PAOX1受甲醇诱导和葡萄糖或甘油的抑制。因此，AOX1的表达受到甲醇的严格控制。
巴斯德毕赤酵母所表达的外源基因位于酵母染色体上，这是通过把携带外源基因的表达质粒线性化，以同源重组的方式整合到强启动子PAOX1的下游，目的基因一般插入到5’AOX1启动子和转录终止子之间的单克隆位点。
毕赤酵母蛋白表达系统
1.酵母表达宿主菌. Mut+和Muts
在毕赤酵母表达系统中，乙醇氧化酶有两种基因编码，即AOX1和AOX2。细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力有AOX1提供，菌株利用甲醇的速度主要由AOX1基因表达的AOX1蛋白提供。当AOX1缺失，只存在AOX2时，大部分的乙醇氧化酶活力丧失，这种细胞利用甲醇能力低，在甲醇培养基上生长缓慢的菌株表现型为Mut。存在AOX1，细胞利用甲醇正常生长，在甲醇培养基上生长较快，这种菌株表现型为Mut*，这就是甲醇营养型毕赤酵母表达两种Muts和Mut+产生的原理。
酵母表达系统常用宿主菌
GS115、KM71、SMD1168是常用的表达宿主菌，均为甲醇诱导型。他们都是组氦酸缺陷型，如果表达载体上带有组氨酸基因，可以补偿宿主菌的组氨酸缺陷，所以可以在不含组氨酸的培养基上筛选重组转化子。在以葡萄糖或者甘油等为碳源的培养基上生长时，AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时，宿主菌的
AOX1基因被强烈诱导，使目的基因大量表达。
有无甲醇诱导产生的Mut+和Mut5表现型
毕赤酵母的最适生长温度为28-30℃，诱导期间超过32℃，不利于蛋白表达，并可能导致细胞死亡。Mut和Mut*菌株在没有甲醇存在的情况下生长速率一样，存在甲醇的情况下，AOX1启动子被强烈诱导，Mut*较 Mut5生长更快(4-5倍)。
2.酵母蛋白表达载体
酵母蛋白表达载体的选择
酵母表达产物有胞内表达和分泌到胞外表达两种方式，这取决于表达载体的选择和构建是否带有信号肽，可根据基因表达的定位及目的选择合适的酵母蛋白表达载体。
胞内表达载体:主要包括pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2等。该类载体将目的基因表达在胞内，可避免酵母的糖基化，适合于通常在胞浆表达或不含-S-S-的非糖基化蛋白，较胞外分泌表达水平高但纯化相对复杂。分泌到胞外表达的载体: pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P等。酵母本身分泌的外源蛋白很少，将外源蛋白分泌到胞外，有利于目的蛋白的纯化和积累。常用的分泌信号序列由89个氨基酸组成αx交配因子的引导。
多拷贝插入表达载体: pPIC9K、pPIC3.5K。某些情况下，重组基因的多拷贝整合能够增加蛋白的表达量。
·表达重组蛋白使其具体天然的N端
想实现表达重组蛋白使其具体天然的N端，将目的基因直接连接在Kex2蛋白酶切位点之后。Kex2蛋白酶切位点在信号肽序列中谷氨酸和精氨酸连接处:Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala *位置为Kex2蛋白酶的酶切位点
毕赤酵母表达系统机制/原理
毕赤酵母能够高效的表达外源基因，是因为其具有强启动子乙醇氧化酶启动子(AOX1和AOX2)。AOX1和AOX2及其产生的Mut和Mut*表现型前文已经叙述过。AOX1受甲醇的诱导和葡糖糖或甘油的抑制。毕赤酵母表达的外源基因位于酵母染色体上，通过把构建的质粒/载体线性化(主要采用酶切)，通过同源重组的方式整合到启动子AOX的下游，一般是插入到5’AOX启动子和转录终止子信号之间的单克隆位点。
毕赤酵母同源重组的方式，见酵母蛋白表达系统介绍。
酵母蛋白表达实验流程
酵母蛋白表达步骤/实验流程
本文主要讲述了酵母蛋白表达步骤，详细酵母表达流程。从感受态细胞制备，转化方法选择及操作，从化学试剂PEG1000转化，电击转化，原生质体法转化三个方法入手及转化子的筛 选及最终的蛋白表达，全套酵母蛋白表达标准操作流程。
质粒线性化
在酵母表达系统中已经介绍了酵母蛋白表达原理，因此线性化是酵母转化的第一步，采用不同的限制酶酶切可以得到不同的表型。
转化方法
毕赤酵母PEG1000转化及感受态制备
配置缓冲液
1）缓冲液A:1.0M山梨醇，10mM甘氨酸，pH8.35,3%(v/V)乙二醇，滤膜过滤，-20℃保存;2)缓冲液B: 40% (w/v)PEG1000，0.2M甘氨酸,pH8.35，滤膜过滤，-20°℃保存;
3）缓冲液C:0.15M NaCl，10mM甘氨酸，pH8.35，滤膜过滤，-20℃保存;
4)未污染的新鲜、试剂级DMSO,-70°C保存
将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处(即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降;样品的转化，进行多组试验。
感受态制备
1）接种酵母受体菌单菌落于YPD平板(YPD:蛋白表达试剂配置)，30°℃培养2天;2)挑取平板上的单菌落接种于10mIYPD液体培养基中，30°℃摇床震荡过夜;
3)过夜培养后按1%左右的接种量接种到100mIYPD培养基中震荡培养至OD值从0.1至0.5~0.8;4) 3000~5000rpm离心收集沉淀菌体，用50ml预冷A液洗涤，并重悬与4mlA液中;
5）根据每次使用量(0.1-0.2ml左右)分装与1.5ml离心管中，每管加入10ul的预冷DMSO，混合后迅速-80℃/液氮（感受态可以放到-80℃，但是酵母表达建议感受态现做现用)
·酵母转化
1)线性化质粒50ug (可预冷）溶于200ul的TE中，直接加入冻存的酵母感受态中;2) 37°℃水浴5min，过程混合样品2次;
3）取出加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀;4) 30°C水浴1小时;
5）室温2000rpm离心10min，去上清，得沉淀，重悬菌体与1.5ml缓冲液C中;6）再次离心，去上清，得沉淀，轻轻加入0.2ml缓冲液C重昙;
7）将重悬的转化液涂与选择性培养基（根据抗性配置)中，30℃孵育3-4天，进行鉴定。
毕赤酵母电击感受态细胞制备及转化
感受态制备
1）接种酵母受体菌单菌落于YPD平板，30°℃培养2天;
2）挑取平板上的单菌落接种于10mlYPD液体培养基中，30°C摇床震荡过夜;
3)过夜培养后按1%左右的接种量接种到100mIYPD培养基中震荡培养至OD值1.2~1.5;4) 4℃，5000rpm离心5min收集沉淀菌体，用100ml预冷无菌水重悬菌体;
5)4℃，5000rpm离心10min收集沉淀菌体，用100ml预冷无菌水重悬菌体;6)再次4℃，5000rpm离心10min收集沉淀菌体，用100ml预冷无菌水重悬菌体;7) 20ml，1mol/L山梨醇洗涤1次;
8）将菌体溶于200ul，1mol/L预冷山梨醇中，不加甘油，-80℃放置几小时，待转化
·酵母电转
1）准备好80ul的酵母感受态与线性化的质粒1-5ug (冰上预冷15min)混合，迅速放入0.2cm的电击杯中(电击杯冰上预冷灭菌)，电击;
2）电击结束，迅速加入1ml山梨醇，涂平板（在摇床上培养1h后涂平板也可);3）MD培养基生长3-4天，ROB培养基上生长4-5天后，鉴定。
·电击注意点
1）线性化质粒的含量在1-5ug，纯度越高越好，量要有保证，很多人找不到阳性转化子可以考虑是否是这个因素造成;
2）感受态菌液收集，确定OD值在1.2-1.5之间，可以稀释不同倍数，判断是否是线性关系，菌液浑浊单OD值不高，可能是OD稀释倍数不够;
3）感受态保存，感受态制备但其他还没处理好，冰上放置的时间对转化效率也会有影响，因此还是那个原则;现做现用;且分装成每次够用的量，一旦拿出就不在放回，也避免每次吸取造成污染;
4)电击杯清洗，先洗净吹干，浸泡在75%乙醇中，使用前超净台紫外灭菌，重复使用对实验也会有一定影响;5）电击参数，电压及电击时间可以摸索，适当增加电压或延长电击时间，电击过程冰上操作
毕赤酵母原生质体法转化及感受态制备
·原生质转化原理
酵母细胞具有细胞壁，细胞壁会组织其对外源DNA的摄入，因此，去除掉部分的细胞壁有利于酵母细胞对DNA的吸收。利用藤黄节杆菌酶（为一种葡聚糖酶），可以部分消化细胞壁。关键在于不能过度的消化细胞壁，否则将造成细胞死亡。藤黄节杆菌酶的消化能力受到SDS的影响，可以加入SDS对其消化进行控制，以得到消化适度的细胞。消化获得70%的原生质细胞时，效果最好。
·试剂配制
转化当天，配制如下溶液:
SE:1M山梨醇，25mM EDTA,pH8.0
SCE: SE: 1M山梨醇，1mM EDTA，10mM柠檬酸钠缓冲液，pH8.5ssos: 1M山梨醇，0.3xYPD，10mM CaCl2
CaS: 1M山梨醇，10mM Tris-HCl，pH7.5，10mM CaCl2DTT，PEG: DTT水配制为1M浓度，PEG用水配制40% (w/v)CaT: 20mM Tris pH7.5,20mM CaCl2
⑦藤黄节杆菌酶:用水配制成3mg/ml的浓度⑧5%SDS溶液，RD融化琼脂100ml，1M山梨醇每次转化时配制
SED: 19mlILSE加1ml DTT
PEG/Cat: 1:1混合40%PEG及Cat其他试剂
YPD培养基1L，YPD平板1LRDB平板1L，RDHB平板1L
·感受态制备及消化细胞壁
1)接种酵母受体菌单菌落于YPD平板，30°℃培养2天;
2）挑取平板上的单菌落接种于10mIYPD液体培养基中，30℃摇床震荡过夜;
3）取培养的细胞5ul，10ul，20ul分别加入到含有200mILYPD的液体培养基中，30℃C震荡过夜(300rpm) ;4)第二天测每个培养瓶中的OD600值，并取出事先配置好的转化溶液，室温放置:
5）收集OD600值在0.2-0.3对应的培养瓶中的细胞，室温离心(1500rpm5min左右)，得到沉淀;如果没有培养瓶中的OD值在0.3左右的话，选择一个培养瓶，用新配置的培养基以1:4稀释，再次培养(2-3h左右)，直至出现OD值为0.2-0.3，收集细胞;
6)准备去除细胞壁，准备去壁试剂和待去壁的细胞;
7)准备去壁试剂:现配SED，保证DTT(分析级)的新鲜度，配完放-20°℃;
8）准备带去壁细胞:先用灭菌水清洗，转入离心管;1500rpm离心5min，收集细胞，用20mISED重悬并洗涤离心;再次用1M山梨醇洗涤，离心(同上)﹔用SCE重悬，分开至两个离心管中（每管10ml左右);
9）准备藤黄节杆菌酶，取―管酶放置冰上，以上准备的两管细胞取出一管加入藤黄节杆菌酶，开始消化细胞(这—步可确定酶消化的最佳时间);
最佳时间的确定
准备20ml 5%SDS溶液分光光度计调至800nm，空白对照为800ul5%SDS及200ul SCE;②准备10个离心管，编号为0,2,4,5,6,7,8,9,10,15,20,25,30,40,45,50(根据时间编号);取上述8步中的另—管细胞，取出200ul加入至0号管中，放置冰上，此为0点;
加入7.5ul藤黄节杆菌酶在剩余的细胞中，轻混，30C孵育（不要晃动)用来建立最佳时间所用2min时取200ul悬浮液至2号管中，同理4,5,6,7,8min时重复操作，读样品OD800值;
用公式计算细胞去壁的效率:%去壁率=100-{ (T时间OD800-0时间OD800值)x100}
10）计算出去壁率为70%左右时，得出最佳消化时间，同样操作加入7.5ul消化酶于另一管中消化细胞11)室温离心去除悬浮液，1M山梨醇洗涤一次，0.6mlCaS悬浮细胞，立即转化，去壁的细胞应立即转化。
转化毕赤酵母
1）取100ul将去壁细胞，放入1.5ml离心管中(灭菌);
2)准备10ug线性化质粒（预冷）与去壁细胞混合，加入1ml新鲜PEG/Cat溶液，轻混，室温孵育10min;3）室温750rpm离心10min，去除PEG/Cat溶液;并用150ulISOS培养基悬浮转化细胞，室温孵育20min;4)加入800ul 1M山梨醇，涂平板;
5）取200ul转化细胞和RD(液体）混匀倒于RDB平板上，凝固后导致平板，30℃培养4-6天，出现转化子;6）取100ul稀释细胞，与RDH（(液体)混匀，涂在RDHB上，凝固后倒置生长，30℃培养4-6天，出现克隆，表明去壁细胞可再次生长为分裂细胞。
阳性转化子的筛选与蛋白表达- Mut+和Mut表型的判断
待转化子在平板上生长一段时间后，进行Mut*和Mut的筛选。挑取单克隆，在MM及MD培养基上划线或点(先在MM平板上点，再在MD平板上点，一个克隆换一次牙签)，30C培养2天。观察，在MD培养基上生长而在MM培养基上不生长或长的很小即为Mut5表型，其余为Mut+表型。
Mut+的诱导表达
1）挑取单菌落，摇菌，在25mlIMGY或BMG或BMGY培养基中，30°℃C，30Orpm培养至OD600为2-6(培养15-18h左右观察);
2）室温2000rpm离心5min，收集菌体，用上述培养基重悬，使OD600为1.0左右;将菌液至于1L摇瓶中，30°C300rpm培养，每24小时加入100%甲醇，至终浓度为0.5-1.0%;
3）根据时间点取样（1ml）至于1.5ml离心管中，离心收集上清和菌体，分析蛋白表达量和最佳收获时间;
4)可以用SDS-PAGE和Western blot进行分析鉴定表达情况。
Mut5的诱导表达
1）挑取单菌落，摇菌，在25mlMGY或BMG或BMGY培养基中，30°C，300rpm培养至OD600为2-6(培养15-18h左右观察);
2）室温2000rpm离心5min，收集菌体，用上述培养基重昙，使OD600为1.0左右;将菌液至于1L摇瓶中，30°℃300rpm培养，每24小时加入100%甲醇，至终浓度为0.5-1.0%;
3）根据时间点取样(1ml)至于1.5ml离心管中，离心收集上清和菌体，分析蛋白表达量和最佳收获时间;4）可以用SDS-PAGE和Western blot进行分析鉴定表达情况。