SSH——抑制性差减杂交

SSH——抑制性差减杂交

差异表达cDNA(目标)存在于检测子cDNA中而在驱赶子cDNA中缺失或丰度较低。

检测子与驱赶子双链cDNA首先用四碱基限制性内切酶消化产生平末端。再把检测子cDNA片断分成两份（1和2）分别与接头1和接头2连接，形成两组检测子，（1）和（2）。接头的末端无磷酸基团消化，那样每个接头中只有较长的链才能共价结合上cDNA的5΄端。

SSH技术用了两次杂交，第一次中把过量的驱赶子加到每份检测子样品中。然后将样品热变性并退火。检测子单链cDNA片断（a）被均化，即平均高、低丰度的cDNA浓度，使其基本相等。均化的发生是因为据杂交的二级动力学（19），重退火过程中高丰度分子能更快产生同源杂交cDNA(b)。而且，检测子的单链cDNA(a) 片断中差异表达基因的cDNA被显著富集，而 “共有的”非靶标cDNA与驱赶子形成异源杂交体。

在第二次杂交中，经过第一次杂交的两份样品被混合。只有保持均化并消减的检测子cDNA能重新结合形成（b）,(c)和新的（e）杂交体。这一阶段加入的第二部分变性驱赶子进一步定集了差异表达基因的部分（e）。新形成的（e）杂交体具有能区分于第一、二次杂交中形成的杂交体（b）和 (c)的重要特征，就是其在5΄端有不同的接头序列，一者来自于样品1，一者来自于样品2。这两个序列使得在PCR中用P1和P2这对各自对应于接头1和2外部的引物时，可以优先扩增消减和均化的片断（e）。要完成选择性扩增，在PCR进程前需进行一个延伸反应补平这些分子粘性末端，以便于引物退火。

在所有PCR循环中，只有（e）型分子才能被指数级扩增。（b）型分子因含有长反转重复序列末端，而在每次变性－退火PCR步骤后形成稳定的“锅柄样”结构。“锅柄样”结构不能作为指数级PCR的模板，因为长接头序列的分子内退火比短得多的PCR引物与模板间的分子间退火要更优先和稳定（14，15）。这就是抑制性PCR的效应。而且，（a）型和（d）型分子不含引物结合位点，（c）型分子只能以线性速率被扩增。只有（e）型分子在其末端具有不同的接头序列，使其能够在PCR中得到指数级扩增。描述（e）片断形成过程和富集率的数学模型与计算将另行给出（20）