2021-12-17

Nature cancer | ERK1/2磷酸化预测抗PD-1免疫治疗后的生存率

原创 骄阳似我 图灵基因 2021-12-17 07:03

收录于话题#前沿分子生物学机制

撰文：骄阳似我

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亮点：

ERK1/2磷酸化（p-ERK）是MAPK/ERK通路激活的标志，可预测两个独立复发性胶质母细胞瘤（rGBM）患者队列中佐剂PD-1阻断后的总体生存率。单细胞RNA测序和多重免疫荧光分析显示，p-ERK主要定位于肿瘤细胞，高p-ERK GBM含有肿瘤浸润性髓样细胞和小胶质细胞，MHC类表达升高 II和相关基因。这些发现表明rGBM中ERK1/2的激活可预测PD-1阻断的反应，并与不同的髓系细胞表型相关。

胶质母细胞瘤（GBM）患者的预后较差，中位总生存期（OS）约为21个月。尽管放射、化疗和肿瘤治疗领域在诊断时已确立，但在复发时却没有有效的治疗方法。这在一定程度上归因于GBM臭名昭著的分子和微环境异质性，这导致了对治疗的不稳定和不可预测的反应。因此，GBM患者对治疗的可变反应通常表现为阴性临床试验，其中难以捉摸的一部分患者表现出反应。免疫检查点阻断在癌症治疗中取得了前所未有的进展，甚至在晚期转移性疾病的情况下，也导致了长期缓解。它已被作为晚期黑色素瘤、非小细胞肺癌、透明细胞肾细胞癌、DNA错配修复（MMR）缺陷或微卫星不稳定性（MSI）的实体瘤以及越来越多的癌症的标准治疗方法。相比之下，其成功在GBM中受到限制，部分原因是内源性和医源性免疫抑制的多样性和迭代机制。除其他因素外，这些因素包括免疫抑制细胞的肿瘤浸润、抗原处理和呈递机制的缺陷、骨髓中T细胞的隔离以及频繁使用免疫抑制药物，如皮质类固醇。阴性试验表明，免疫检查点阻断对GBM患者总体上缺乏疗效，但一些患者出现了持久的临床反应。

近期，在Nature cancer杂志上发表了一篇名为“ERK1/2 phosphorylation predicts survival following anti-PD-1 immunotherapy in recurrent Glioblastoma”的文章，报告了一项对使用辅助PD-1阻断剂治疗复发性GBM（rGBM）患者的分析，发现了与这种免疫治疗反应相关的分子特征。BRAF-和PTPN11激活突变，驱动MAPK/ERK通路信号，在对PD-1阻断反应的rGBM中富集。为了确定除携带BRAF或PTPN11突变的肿瘤外对PD-1阻断敏感的肿瘤，本文探讨在PD-1阻断后反应和延长生存期的rGBM中是否存在MAPK通路激活。在接受PD-1阻断治疗的rGBM患者及未接受免疫治疗的rGBM患者标本中分析了ERK1/2磷酸化（p-ERK），即MAPK信号下游效应器的活性形式。此外，通过人类GBMs的多重免疫荧光和单细胞RNA测序（scRNA-seq）评估ERK1/2激活升高患者肿瘤微环境的表型和细胞差异。

为了研究MAPK通路激活是否与抗PD-1治疗反应相关，使用免疫组织化学（IHC）在GBM中评估了p-ERK。首先调查p-ERK染色是否与PD-1阻断反应相关，使用Cox比例风险模型进行单变量和多变量分析，以评估p-ERK细胞密度与生存率的相关性。结果表明，高p-ERK仅在抗PD-1治疗的情况下与生存获益相关，因此作为生物标志物具有预测性，但不能预测预后。接下来通过对结果和治疗不知情的神经病理学家的评分，研究了使用p-ERK染色预测PD-1阻断反应的可行性。分析表明，基于计算机的p-ERK定量可能比病理学家的评分更具可重复性和可靠性。调查了p-ERK细胞密度升高及其与PD-1阻断后长期生存率的相关性，而与BRAF/PTPN11激活突变无关。有趣的是，与存活时间<12个月的患者相比，PD-1阻断开始后存活时间>12个月的患者p-ERK+细胞密度升高。在存活时间>12个月的患者中，5例为野生型BRAF和PTPN11，4例为这些基因的激活突变，2例为未知BRAF/PTPN11突变状态。这些结果表明，无论BRAF/PTPN11基因的遗传状态如何，在抗PD-1治疗中经历较长OS的患者始终表现出高水平的p-ERK。总的来说，这些结果表明p-ERK染色具有特异性，是复发性GBM PD-1阻断后的预测性生物标志物。

图1|通过半自动IHC定量评估ERK1/2磷酸化，表明它是复发性GBM PD-1阻断后的预测性生物标志物。

随着时间的推移，肿瘤细胞表型和相关微环境会发生变化，尤其是在新诊断的GBM和复发性疾病之间。为了研究用于p-ERK测定的组织相对于PD-1阻断剂的起始时间是否影响该生物标记物的预测特性，使用在临床试验开始PD-1阻断前不同时间点获得的配对样本，其中包括接受辅助PD-1阻断的一只手臂。结果表明，在PD-1阻断开始前不久获得的肿瘤更可靠地预测rGBM患者对PD-1阻断的反应。此外采用Cox比例风险模型，使用研究中的肿瘤样本，测试p-ERK细胞密度与生存率的相关性。结果表明从接近PD-1阻断起始的GBM样本中获得的p-ERK的预测能力。此外，这些结果验证了初步观察结果，即高p-ERK与辅助PD-1阻断治疗患者的长期生存相关。图2 |在使用辅助PD-1阻断剂治疗的独立复发性GBM队列中，预处理p-ERK染色与OS相关的验证。

为了研究哪些细胞群有助于GBM中p-ERK的表达，在GBM样本中进行多重免疫荧光，评估p-ERK和肿瘤微环境中的主要细胞群，包括SOX2（肿瘤标记）、TMEM119（小胶质细胞标记）、CD163（巨噬细胞标记）、DAPI标记细胞核。通过量化这些细胞群，发现相对于TMEM119+细胞，p-ERK主要在SOX2+细胞、CD163+细胞和其他细胞中检测到。与低p-ERK胶质瘤相比，高p-ERK胶质瘤中SOX2+p-ERK+细胞的数量更多。例如一种BRAFV600E突变的GBM和一种野生型BRAF/PTPN11肿瘤，这两种肿瘤都有SOX2+细胞高水平表达的p-ERK。相反，在被IHC分类为ERK1/2激活水平较低的rGBM中，大多数SOX2+细胞对p-ERK呈阴性。这些结果表明，胶质瘤中的大多数p-ERK+细胞是肿瘤细胞，免疫细胞和基质细胞的贡献较小。考虑到GBM微环境中髓样细胞的丰富性及其在GBM中对免疫检查点抑制剂的反应和耐药性中的意义，分析了p-ERK细胞密度是否与这些免疫细胞在GBM中的浸润有关。发现与低p-ERK肿瘤相比，高p-ERK肿瘤的GBM中TMEM119+细胞数量增加。相反，在p-ERK水平高与低的胶质瘤中，浸润CD163+细胞的胶质瘤数量没有差异。用巨噬细胞/小胶质细胞标记物Iba1对胶质瘤样本进行IHC染色，并评估其与p-ERK细胞密度的相关性。发现通过IHC量化得出的p-ERK细胞密度与标本中的Iba1+细胞密度相关。图3 |复发性GBM样本的多重免疫荧光显示SOX2+细胞中的p-ERK阳性和相关的髓样细胞浸润。

接下来进行空间分析以进一步研究SOX2+p-ERK+细胞和胶质瘤浸润髓样细胞之间的相互作用。计算了TMEM119+和CD163+细胞与SOX2+p-ERK+细胞之间的距离。发现与低p-ERK肿瘤相比，高p-ERK肿瘤中TMEM119+细胞更接近SOX2+p-ERK+细胞。相反没有发现TMEM119+细胞和SOX2+p-ERK细胞之间的距离差异。同样，高p-ERK肿瘤中CD163+细胞与SOX2+p-ERK+之间的距离比低p-ERK肿瘤短，但CD163+细胞与SOX2+p-ERK之间的距离没有差异。同样，当使用GFAP+标记肿瘤/星形胶质细胞来测量肿瘤细胞与髓系细胞之间的距离时，发现高p-ERK的肿瘤从CD163+细胞到GFAP+p-ERK+的距离比低p-ERK的肿瘤短，而GFAP+p-ERK在这些距离上没有差异。这些结果表明，p-ERK+细胞数量增加的胶质瘤与髓样/小胶质细胞的高浸润有关。与免疫细胞和肿瘤区域分离的其他实体瘤相比，浸润髓样细胞的胶质瘤附近的p-ERK+肿瘤细胞数量增加表明这些细胞群之间存在高度混合。图4|表达p-ERK的肿瘤细胞及其相关髓系细胞的空间分析。

鉴于在肿瘤细胞中观察到的髓样细胞浸润与ERK1/2激活的相关性，使用scRNA-seq研究了这些免疫细胞的表型。分析了10个GBM标本中的28194个细胞，这些细胞与p-ERK IHC染色配对。采用与发现和验证GBM队列相同的方法对p-ERK细胞密度进行量化，使用相同的切点值将肿瘤指定为高p-ERK与低p-ERK，从而导致五个p-ERK高肿瘤和五个p-ERK低肿瘤。随后根据用于肿瘤细胞（SOX2）、髓样细胞（CD14）、内皮细胞（VWF）和周细胞（PDGFRB）的单细胞转录组学的经验证的细胞标记物的表达对簇进行注释。肿瘤细胞聚集成几个样本依赖组，而来自所有GBM样本的髓样细胞室、周细胞和内皮细胞则均匀聚集。鉴于骨髓细胞在p-ERK升高的肿瘤中的浸润增加，以及它们在GBM免疫检查点阻断中的免疫调节作用，将分析重点放在骨髓细胞上。为了研究高p-ERK和低p-ERK肿瘤之间骨髓细胞群中的转录差异，进行了基因集富集分析（GSEA）和基因本体论（GO）集合。高p-ERK肿瘤的髓样细胞中有27条GO通路显著富集。有趣的是，在与淋巴细胞趋化性、趋化因子和抗原呈递相关的几个其他GO主题中，在浸润高p-ERK肿瘤的髓样细胞中富集的顶级基因集是GO术语“MHC classII蛋白复合物结合”。相比之下，没有发现低p-ERK肿瘤髓样细胞中有显著的基因集富集。鉴于高p-ERK GBMs髓样细胞中MHC classII蛋白复合物结合GO项富集，研究了这些髓样细胞是否也表达MHC classII（MHCII）分子。采用多重免疫荧光染色来评估SOX2（肿瘤细胞标记物）、CD163（髓细胞标记物）、TMEM119（小胶质细胞标记物）、MHCII和DAPI。该分析显示，与低p-ERK肿瘤相比，高p-ERK肿瘤的TMEM119+细胞的MHCII蛋白表达升高。还观察到高P-ERK肿瘤的CD163+细胞相对于低P-ERK肿瘤的MHCII表达。总的来说，这些结果表明，ERK1/2激活增强的肿瘤具有特定的微环境特征，其中髓样细胞（主要是小胶质细胞）表达MHCII和与该抗原呈递分子相关的基因特征。图5 |高p-ERK组和低p-ERK组GBM患者的scRNA序列。

当前研究的一个局限性是它没有建立因果关系。因此，p-ERK作为PD-1阻断的预测性生物标志物的潜在机制仍有待确定。尽管在发现和验证队列中发现高p-ERK和低p-ERK GBM患者的OS存在差异，但承认进一步的研究局限性在于分析的患者数量和研究的回顾性设计。因此，评估抗PD-1治疗的这种生物标记物的前瞻性验证很重要。此外，考虑到新辅助PD-1阻断对GBM的潜在治疗益处，另一个未解决的问题是p-ERK1/2是否仍能预测暴露于这种免疫疗法的标本的反应。总之，这些结果表明，p-ERK1/2表明rGBM患者对佐剂PD-1阻断的反应，rGBM患者具有独特的肿瘤免疫微环境，该微环境由表达MHC II的髓样/小胶质细胞组成。这为GBM的个体化免疫治疗提供了机会，为在避免对其他患者进行无效治疗的同时，对患者进行分组。

教授介绍：

AdamM Sonabend

Sonabend博士是墨西哥人。他在墨西哥国立自治大学（UNAM）医学院获得医学学位，并以全班第一名的成绩毕业，为此他被墨西哥国立自治大学授予GabinoBarreda奖章。毕业后，Sonabend博士在芝加哥大学从事转化脑肿瘤研究。随后，他在纽约长老会医院哥伦比亚大学医学中心完成了神经外科培训。除了接受一般神经外科培训外，他还接受了神经外科肿瘤学的广泛培训。Sonabend博士于2015年在哥伦比亚大学开始了他的职业生涯，当时他在完成住院医师培训后首次加入该部门。他发表了50多篇同行评审的文章，书籍章节以及国家和国际演讲。他是神经外科医生协会研究奖（2009年），神经外科研究和教育奖学金奖（2012年）以及哥伦比亚大学高级教务长办公室的多样性招聘奖（2015年）的获得者。2015年，他是16位科学家之一，也是美国唯一一位获得着名的5年NIH主任早期独立奖（DP5）的神经外科医生，价值超过200万美元。

参考文献：

Arrieta, V.A., et al., ERK1/2 phosphorylation predicts survival followinganti-PD-1 immunotherapy in recurrent glioblastoma. Nature Cancer, 2021.