实验复盘㈣----重组质粒DNA小提

质粒提取原理

从细菌中分离质粒DNA的方法包括三个基本步骤：培养细菌使质粒扩增，收集和裂解细胞，分离和纯化质粒DNA。
当用强碱处理时，细菌的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA的两条链不会相互分开，当外界条件恢复正常时，线性染色体DNA片段难以复性，而是与变性的蛋白质和细胞碎片缠绕在一起，而质粒DNA双链又恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，并以溶解状态存在于液相当中。

质粒小提试剂盒（TIANprep Mini Plasmid Kit 离心柱型）--碱裂解法
本试剂盒采用碱裂解法裂解细胞，再通过离心吸附柱在高盐状态下特异地结合溶液中的DNA。
碱裂解法抽提质粒主要的试剂为溶液P1,P2,P3，其在抽提质粒DNA中的作用如下：

溶液P1：由葡萄糖、EDTA、Tris-HCl组成。葡萄糖的作用是增加溶液的黏度，减少抽提过程中的机械剪切作用，防止破坏质粒DNA。EDTA的作用是络合Mg²⁺等二价金属离子，防止DNA酶对质粒分子的降解作用。Tris-HCl能使溶菌液维持溶菌作用的最适pH范围。
溶液P2：由SDS和NaOH组成。SDS的作用是解聚核蛋白并与蛋白质分子结合使之变性。NaOH的作用破坏氢键，使DNA分子变性。
溶液P3：由KAc和HAc组成，是pH为5.5的高盐溶液。能中和溶液P2的碱性，使染色体DNA复性而发生缠绕并使质粒DNA复性。K⁺会与SDS形成溶解度很低的盐并与蛋白质形成沉淀而容易除去。溶液中的染色体DNA也会与蛋白质-SDS形成相互缠绕的大分子物质，很容易与小分子质粒分离。此外，高盐溶液也有利于各种沉淀的形成。

Prepare:
检查试剂盒里的试剂是不是都在，2mL灭菌离心管，涡旋振荡器，12000rpm离心机，ddH₂O 65℃水浴锅预热，溶液P1保存在4℃冰箱中。

试剂盒产品组成.png

实验前仔细阅读注意事项：
1：检查溶液P1中是不是加了RNaseA？
2： 实验前使用平衡液BL处理吸附柱CP3
3：检查漂洗液PW是不是加入无水乙醇？
4：80μLddH₂O洗脱2遍，中间静置2min后离心2min。

注意事项.png

Mini point：
溶液P1（Tris-Hcl，EDTA，Glucose）：将菌体沉淀悬浮起来
-葡萄糖有利于重悬菌体，可以增加溶液的黏度，维持渗透压，也有利于溶液pH的调节；
EDTA可以鳌和溶液中的钙镁二价金属离子，抑制依赖于这些金属离子的DNA酶的活性 ，防止质粒DNA被降解；
溶液P2（NaOH，SDS）：裂解细胞
溶液P3（乙酸钾，乙酸）：中和NaOH，使质粒DNA复性。
Steps：

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1. 吸附柱CP3柱平衡；

2. 菌液离心3次（12000rpm，1min），收集菌体;

3. 加250μL溶液P1，涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀；

4. 加250μL溶液P2，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解；

5. 加350μL溶液P3，立即温和地上下翻转6-8次，充分混匀，此时出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min。
   

   白色絮状沉淀.jpg

6. 移液器转移上清液到吸附柱CP3中，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；

7. 加600μL漂洗液PW，12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中；

8. 重复操作步骤8；

9. 空甩2min，在超净台里开盖使乙醇挥发（10min）；

10. 将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间滴加50μLddH₂O 洗脱两遍；

11. 吸取20μL质粒送测序，保存至-20℃冰箱。

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裂解完全图例.png

图片来自天根官网.png

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Reference:
1.分子生物学实验教程
2.天根质粒小提试剂盒说明书