内质网应激+预后模型新方向，干湿结合搞定5+sci

今天给同学们分享一篇内质网应激+预后模型+实验的生信文章“Endoplasmic Reticulum Stress-Related Ten-Biomarker Risk Classifier for Survival Evaluation in Epithelial Ovarian Cancer and TRPM2: A Potential Therapeutic Target of Ovarian Cancer”，这篇文章于2023年9月12日发表在Int J Mol Sci期刊上，影响因子为5.6。

上皮性卵巢癌（EOC）是最致命的妇科恶性肿瘤。内质网（ER）应激在多种肿瘤的恶性行为中起着重要作用。本研究基于与ER应激相关的10个差异表达基因建立了一个风险模型，用于评估患者的预后，并帮助制定EOC病例的新型医疗决策。

1. 差异表达的ERGs（DEERGs）的特征

作者研究的简要流程图如图1所示。总共，在卵巢肿瘤样本与正常组织比较中，鉴定出7617个显著差异表达基因（DEGs）（图2A）。在DEG和ERG集合重叠后，得到了422个DEERGs（图2B）。

图1 学习流程图

图2

2. ER应激相关模型的构建和验证

首先，进行了单变量逻辑回归，并生成了与TCGA-OV队列中总生存显著相关的61个候选DEERGs。然后，使用LASSO回归去除了候选DEERGs中过拟合的基因，得到了18个基因（图2C，D）。最后，通过对LASSO选择的18个基因进行多步回归分析，筛选出了包括10个候选DEERGs的内质网应激相关模型（图2E）。

还研究了与内质网应激相关的模型对卵巢癌患者预后结果的预测价值。在TCGA-OV队列中，低风险组和高风险组的生存曲线之间存在显著差异，高风险评分的患者预后结果较差（图3A）。此外，ROC曲线显示了良好的预测准确性，其中一年、三年、五年和七年生存率的AUC分别为0.70、0.66、0.73和0.79（图3B）。在分析不同风险评分、随访时间和10个候选DEERG的表达之间的关系后，结果表明随着风险评分的增加，患者的生存率显著降低（图3C）。同时，通过相同的分析在验证队列（GSE32062和GSE140082）中观察到了类似的结果（图3D、E）。

图3 

3. 建立预后评分图

经过单变量、LASSO和多变量COX分析，ER应激相关模型的风险评分被证明是预测卵巢癌患者生存时间的可靠指标。此外，作者根据多变量COX分析结果从TCGA-OV数据集中选择了两个重要的临床变量（R 0 /非R 0 和年龄）。这两个选择的临床变量与风险评分结合起来，开发了一个能够为每个患者预测生存结果的图表（图4B）。较高的值代表较好的生存结果（图4C）。ROC曲线和校准曲线表明，基于模型的图表具有良好的可靠性（图4D、E）。

图4

4. 探索内质网应激相关模型与临床参数之间的关系

作者比较了基于几个临床参数的风险评分水平的差异，例如临床分期、分级和肿瘤类型。在TCGA-OV数据集中，根据肿瘤分级将两组进行分层后，并未发现差异，除了那些临床分期较晚且有原发肿瘤的患者具有较高的风险评分（图5A、B）。

图5

5. 两组中免疫细胞浸润的分析

根据CIBERSORT算法，还实施了22种细胞类型的免疫浸润水平。结果表明，高风险评分组中记忆激活CD4 T细胞、滤泡辅助T细胞、M1巨噬细胞和浆细胞的浸润比例远低于低风险评分组中相应的浸润比例。相反，高风险评分组中M2巨噬细胞和单核细胞的浸润比例高于低风险评分组中相应的浸润比例（图5C）。此外，作者检查了10个免疫抑制检查点的表达水平，以更好地了解两组之间的肿瘤微环境（TME）的差异。在高风险评分组中，BTLA、CD274、CTLA4、LAG3和TIGIT的表达显著下调。相反，CD160的表达在高风险评分组中显著上调（图5D）。

6. 对10个候选差异表达基因进行qPCR分析

在生成的与内质网应激相关的模型中，设计了10个候选DEERGs的引物，并在细胞系中测试了这10个DEERGs的基因表达。qPCR实验的结果与之前的结果一致，表明10个候选DEERGs在正常卵巢上皮细胞和癌细胞之间有显著表达差异（图6）。

图6 在生成的内质网应激相关模型中，对IOSE、A2780、HEY和SKOV3细胞系中10个候选DEERGs

7. TRPM2的抑制阻碍了卵巢癌细胞的凋亡、侵袭和迁移

在10个候选的DEERGs中，在TCGA数据库中发现了TRPM2表达与卵巢癌患者生存之间的显著关联（图7A）。为了探索TRPM2在EOC进展中的作用，对人类EOC细胞系进行了TRPM2的沉默功能实验。通过qPCR确认shRNA敲低的效率（图7B）。在选择的shRNA中，shTRPM2-3表现出最高水平的基因沉默效率，因此被选择用于后续实验。CCK-8实验显示，敲低TRPM2对SKOV3细胞的增殖没有显著影响（图7C）。与对照组相比，TRPM2的下调导致SKOV3细胞的G2/M细胞周期阻滞（图7D），并显著上调了SKOV3细胞的凋亡率（图7E）。此外，划痕实验（图7F）和Transwell侵袭实验（图7G）的结果进一步证明，沉默TRPM2显著降低了SKOV3细胞的迁移和侵袭能力。TRPM2水平的下调导致细胞内活性氧自由基（ROS）水平升高，表明TRPM2可能通过抑制ROS来增强卵巢癌细胞的活性（图7H）。这个结果与其他研究的结论也相似。

图7 在人类SKOV3细胞系中进行TRPM2基因沉默的功能丧失实验

总结

本研究采用了回顾性实验设计。为了部分弥补本研究的限制，作者使用了两个独立的数据集来验证结果。仍然有必要通过基于大样本的前瞻性临床研究来验证预后风险模型的可靠性。此外，还需要进一步研究和探索TRPM2在卵巢癌发病机制中的确切作用及其潜在的治疗价值。