ChIP-Seq分析流程记录

ChIP-seq简介

概念: ChIP-Seq是用于在全基因组范围中研究DNA结合蛋白（相互反应）、组蛋白修饰（表观遗传标记）和核小体的技术，研究这三个主题可有助于了解基因之间的相互调控以及染色体的功能结构。

ChIP-Seq实验原理: 在生理状态下，把细胞内的DNA与蛋白质交联（Crosslink）后裂解细胞，分离染色体，通过超声或酶处理将染色质随机切割，利用抗原抗体的特异性识别反应，将与目的蛋白相结合的DNA片段沉淀下来，再通过反交联（Reverse crosslink）释放结合蛋白的DNA片段，最后测序获得DNA片段的序列。

注意:当研究重点是得到核小体的位置和组蛋白修饰的位置的时候，实验中并不首先进行crosslink，而是用超声或者MNase直接进行打断，优先使用MNase，可以更高效地去除掉linker DNA片段以得到核小体更为精确的位置。

空白对照:：空白对照是必要的，存在很多假阳性情况，举例：1. 开放的染色体区域更容易被打断成片段，这样导致tag数在基因组上的分布是不均匀的;2.很多重复序列会使做map的时候得到结果难以解释。空白对照的用途：可以判断由ChIP-Seq得到的peak时候具有统计上的显著性。

三种类型的空白对照：1.部分进行免疫共沉淀前的DNA（input DNA），这是最常用的；2.由免疫共沉淀得到而不含有抗体的DNA(mock IP DNA)，使用这个的一个问题是收集到的量可能不够；3.使用非特异免疫共沉淀方法得到的DNA.

SRA数据下载

以拟南芥转录因子AP1为例(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE46986), 下载对应的ChIP-seq(SRR851698)和Control(SRR851703)数据

axel -n 20 ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR851/SRR851703/SRR851703.sra
axel -n 20 ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/sra/sra-instant/reads/ByRun/sra/SRR/SRR851/SRR851698/SRR851698.sra

SRA转换为FASTQ

# 参数--split-3可自动识别单端还是双端数据
fastq-dump --split-3 SRR851703.sra
fastq-dump --split-3 SRR851698.sra

Trimmomatic过滤低质量的reads

# 该示例数据未单端
java -jar trimmomatic-0.36.jar SE -phred33 SRR851703.fastq SRR851703_filtered.fastq LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36
java -jar trimmomatic-0.36.jar SE -phred33 SRR851698.fastq SRR851698_filtered.fastq LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36
# 对于双端数据集
java -jar trimmomatic-0.36.jar PE -phred33 input_1.fastq input_2.fastq input_1_paired.fq input_1_unpaired.fq input_2_paired.fq input_2_unpaired.fq LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36

除此之外，Trimmomatic还包含illumina测序平台的常用接头，因此也可以用于去接头

# 单端
java -jar trimmomatic-0.36.jar SE -phred33 SRR851703.fastq SRR851703_filtered.fastq ILLUMINACLIP:～/Trimmomatic-0.36/adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36
# 双端
java -jar trimmomatic-0.36.jar PE -phred33 input_1.fastq input_2.fastq input_1_paired.fq input_1_unpaired.fq input_2_paired.fq input_2_unpaired.fq ILLUMINACLIP:～/Trimmomatic-0.36/adapters/TruSeq3-PE.fa:2:30:10  LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36

注意：～/Trimmomatic-0.36/adapters/TruSeq3-PE.fa 应为绝对路径

比对到参考基因组

拟南芥(Arabidopsis thaliana)参考基因组下载

wget ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-40/fasta/arabidopsis_thaliana/dna/Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna_sm.toplevel.fa.gz
gunzip Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna_sm.toplevel.fa.gz
mv Arabidopsis_thaliana.TAIR10.dna_sm.toplevel.fa arabidopsis_genome.fa

Bowtie比对

为基因组序列创建index

bowtie-build arabidopsis_genome.fa

使用默认参数比对

# alignment
bowtie arabidopsis_genome.fa SRR851703_filtered.fastq -S SRR851703.sam
bowtie arabidopsis_genome.fa SRR851698_filtered.fastq -S SRR851698.sam
# Conver to bam
samtools view -bS SRR851703.sam > SRR851703.bam
samtools view -bS SRR851698.sam > SRR851698.bam
# sort
samtools sort -o SRR851703.sort.bam SRR851703.bam
samtools sort -o SRR851698.sort.bam SRR851698.bam
# Creat index
samtools index SRR851703.sort.bam
samtools index SRR851698.sort.bam
# Extract uniquely mapped reads
samtools view -h -q 255 SRR851703.sort.bam | samtools view -bhS - > SRR851703_unique_mapped.bam
samtools view -h -q 255 SRR851698.sort.bam | samtools view -bhS - > SRR851698_unique_mapped.bam

MACS2 peak calling

macs2 callpeak -t SRR851698_unique_mapped.bam -c SRR851703_unique_mapped.bam -f BAM -g 1.35e8 -n AP1 -q 0.05