qPCR那些曲线都代表什么？

在qPCR中会与各式各样的曲线打交道，每种曲线都有其不同的意义，甚至能够通过看曲线来发现实验中的一些问题。

 

 

我们知道PCR的本质其实就是一变二、二变四、四变十六······产物呈指数增长的数字游戏。

 

PCR原理

 

因此，在引物、模板、缓冲液、酶等都充足的理想状态下，荧光定量PCR的扩增曲线应该是这样的：

 

理想状态下的扩增曲线

 

然而，理想很疯狂，现实却很“性感”，看下面的“S型”曲线就知道，相对于理想状态下的扩增曲线，在dNTP和酶都有限的情况下，扩增曲线如下图所示，有一个平台期，酶逐渐失活，dNTP消耗殆尽，产物增加量逐渐减少；直至没有任何产物生成，数目保持恒定。

 

实际情况的扩增曲线

 

熔解曲线(Dissociation curve)，就是随温度升高DNA的双螺旋结构降解程度的曲线。扩增反应完成后，通过逐渐增加温度同时监测每一步的荧光信号来产生熔解曲线。

 

熔解温度上有一特征峰（Tm，DNA双链解链50％的温度），用这个特征峰就可以将特异产物与其它产物如引物二聚体区分开，因为它们在不同的温度熔解度不一样。用荧光信号改变的负的一次导数（dR/dT）与温度作图，得出熔解曲线。

 

dR/dT 越大，表明荧光值变化最快。随着温度上升，达到Tm点时，大部分产物双链DNA解开，荧光值下降非常快。如果qPCR产物非常特异，熔解曲线在80-90之间会形成一个单峰(温度和qPCR产物长度以及GC含量相关)。

 

正常情况下，荧光定量PCR的产物是特异的，这时的熔解曲线应该是这样的：

 

正常情况下的熔解曲线

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