本案例基于使用蛋白抗原免疫小鼠产生应答，融合产生杂交瘤细胞筛选阳性单克隆细胞株的方法制备单抗，经检测获得的抗体效价可达1:10万以上，获得可配对的4株抗体。本案例所涉及数据及实验方法结论，未经钟鼎生物授权，任何单位及个人不得转载或盗用，违者必究！
一、实验设计
利用钟鼎表达的重组蛋白SVC做为抗原，免疫BALB/c小鼠，3免后检测效价，达标后取脾脏细胞融合骨髓瘤细胞获得杂交瘤细胞，通过有限稀释法筛选单克隆抗体细胞株，定株后的细胞株所得的腹水进行protein A纯化获得单克隆抗体并进行抗体标记，通过夹心ELISA方法进行检测XXX蛋白。根据检测结果其中4E5.12F5.4C12.4F12纯化的单克隆抗体可互相配对，并进行胶体金标记及试纸条制备。
二、试剂和耗材
名称公司名称公司
DMEM高糖、DMEM低糖、高糖DMEM培养基、胎牛血清、胰蛋白酶、opti SFM、转染试剂等Invitrogen（Gibco）无内毒素质粒中提试剂盒、LAL内毒素检测试剂、基础化学试剂、PEG等Sigma公司
六孔板、细胞培养瓶、离心管corning公司细胞计数板Improved Neubauer
液体石蜡钟鼎生物公司96细胞培养板Costar
其他常规生化试剂均为国产分析纯
三、主要实验仪器
仪器名称公司仪器名称公司仪器名称公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机美国BECKMAN公司台式高速离心机德国SORVAL公司Biologic LP层析系统、Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统美国BIO-RAD公司
PTC-200基因扩增仪美国MJ Research公司320-S pH计美国Mettler Toledo公司AR5120电子天平美国AHOM S公司
MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪美国Amersham Pharmacia公司雪花状制冰机日本SANYO公司JY92-2D超声波细胞粉碎机中国新芝科器研究所
蛋白核酸检测仪南京大学普阳科学仪器厂NANODROP2000美国Thermo公司超净工作台中国苏净集团
四、实验分析及设计
1. 动物免疫
选取6只6-8周龄雌性BALB/c小鼠，将XXX蛋白与弗氏完全佐剂混合首次免疫，皮下注射100ug，2-3周加强免疫一次，采用弗氏不完全佐剂与抗原混合，皮下注射100ug。四免后采血检测，通过间接ELISA方法确定抗血清针对XXX蛋白的效价，待效价大于1:10,000，选择1-2只小鼠进行细胞融合安排。
2.细胞融合
2.1 骨髓瘤细胞制备
融合前一周，用含10%FBS DMEM培养基扩大培养SP2/0细胞。到融合时，细胞长满大约6瓶T25细胞培养瓶，在融合当天收集SP2/0细胞到50ml离心管中，1000rpm,5min离心。弃上清，然后再加入20ml DMEM基础培养基，吹散细胞然后计数。
2.2 脾细胞制备
四次免疫后血清ELISA效价在1：10000以上的小鼠，在融合前3天终免，腹腔注射抗原100ug。融合当天用颈椎脱臼法安乐死要融合的小鼠。用75%酒精浸泡5min.无菌取脾脏，把脾脏放入内有10mlDMEM基础培养的培养皿中。取筛网放入另一个平皿中，将脾脏转移到筛网上，用注射器内心研磨脾脏。加入DMEM到筛网上，冲洗筛网，使脾细胞更多的收集到平皿中。将细胞移至10ml离心管中，用不含血清的DMEM洗脾细胞两次， 1000 rpm离心5min，收集脾细胞计数。
2.3细胞融合
混合骨髓瘤细胞和脾细胞，使骨髓瘤细胞同脾细胞数量比在1：20为宜。把细胞放到50ml离心管中，用DMEM基础培养基稀释，然后离心1000rpm 5min。弃上清。摇动离心管使细胞均匀。缓慢加入0.8ml 50%PEG，反应90秒，然后加入20-30ml DMEM培养基终止PEG，把融合的细胞放到37℃水浴锅中反应10分钟。 1000rpm 5min，弃上清然后加入HAT DMEM培养基. 把融合的细胞铺到96孔板中，每孔100μl。然后将细胞培养板放到CO2培养箱中培养。融合后4天查看，杂交瘤细胞克隆率在50%以上，有少量的细胞碎片，细胞生长状态良好。融合10天后开始进行筛选检测。
3. 融合筛选及亚克隆
3.1 融合筛选
在检测的前一天，用PBS包被5ug/ml抗原于ELISA板，过夜。次日吸取细胞上清100ul/孔进行ELISA检测根据ELISA结果，判断阳性孔（样品孔OD值/阴性孔OD值≥2.1则判定为阳性孔。用单道移液器挑检整板检测出的阳性孔，进行第二次确认检测，进一步确认阳性孔。确定后的阳性孔细胞进行亚克隆。
3.2 亚克隆
吹打阳性孔中细胞，计数，在离心管中加入N/4 ml DMEM培养基，取100ul细胞悬液到离心管中，吹匀后留1ml，补加DMEM到4ml，吹匀，留100ul（约2滴）在管底。在离心管中加DMEM至5ml，混匀后滴加至96孔板的前三行，每孔一滴管底留1.8-2ml左右，补加DMEM至5ml，吹匀后滴加至96孔板的D、E、F三行，每孔一滴，管底留1.5-1.8ml左右，补加DMEM至2.8-3ml左右，吹匀后滴加至96孔板的G、H行，每孔一滴，7-10天后在显微镜下观察，检测有克隆生长的孔，标记出单克隆的孔，尽可能挑取阳性的单克隆细胞进行再次亚克隆，检测至100％阳性后，挑出单克隆孔扩大培养定株。
4. 腹水制备及纯化
4.1腹水制备
每只小鼠腹腔内注射0.5ml液体石蜡，7天后30天以内向预处理过的小鼠腹腔内注射杂交瘤细胞。按每只小鼠注射1x106个细胞的量，注射杂交瘤细胞。7至十天，用注射器针头小心采出尽可能多的液体。小鼠在最后一次采集后颈椎脱位法处死。
4.2 腹水纯化
将所收集的腹水离心取上清，准备好蛋白A琼脂糖介质并装柱，将腹水用PBS稀释10倍后缓慢上样，上样结束后用磷酸盐缓冲液洗涤至紫外检测仪达到最低值，甘氨酸洗脱缓冲液洗脱，即得到所需纯化抗体，立即在PBS中进行4度透析过夜，隔日进行纯度，浓度和效价测定。
五、实验结果
5.1 4免后小鼠血清效价 ELISA 结果
经免疫后小鼠均产生高效价抗血清，具体结果如下：
包被抗原： 蛋白XXX
包被浓度： 5 ug/ml, 100ul / 孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)
二抗： 兔抗鼠-HRP
表 1: 血清Elisa 结果（起始稀释度: 1:500，效价即样品OD/空白OD＞=2.1的最高稀释度）
5.2 融合筛选结果
选取效价较高的3#小鼠进行细胞融合，经ELISA筛选阳性克隆结果如下：
包被抗原： 蛋白 XXX
包被浓度： 5 ug/ml, 100ul / 孔
包被缓冲液： 磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)
二抗： 兔抗鼠-HRP
表 2： 融合后细胞上清ELISA 结果
5.3 亚克隆细胞定株后结果
选取10株阳性细胞进行亚克隆，经ELISA筛选后定7株结果如右：
包被抗原： 蛋白XXX
包被浓度：5 ug/ml, 100ul / 孔
包被缓冲液：磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)
二抗： 兔抗鼠-HRP
说明：定株后的细胞株，选择细胞状态及效价最好的4F12.4C12.12F5.4E5细胞株进行腹水制备和纯化。
5.4 腹水纯化后抗体效价及浓度、纯度检测
（1）定株后细胞株选择所得腹水经纯化后ELISA效价如下：
包被抗原： 蛋白XXX
包被浓度： 5 ug/ml, 100ul / 孔
包被缓冲液： 磷酸盐缓冲液 (PBS, pH 7.4)
二抗： 兔抗鼠-HRP
抗体纯度及浓度检测