生信 | 基因组组装实战（二）：Survey数据质控、NT比对

写在前面

• 以下内容均来自我在菲沙基因（Frasergen）暑期生信培训班上记录的课堂笔记

1. Survey分析的目的

• 看我上一次的：生信 | 基因组组装实战（一）：基础知识与基本思路

2. Survey分析所需要的数据

• 二代基因组高通量测序(如ilumina HiSeq/ BGI等测序平台)得到的原始图像数据文件经碱基识别( Base Calling )分析转化为原始测序序列( Sequenced Reads)，我们称之为Raw Data或Raw Reads,结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列( reads )的序列信息以及其对应的测序质量信息。测序样本中真实数据随机截取结果如下:
  FASTQ文件格式

每个序列共有4行信息:

• 第1行是序列名称，由测序仪产生,包含index序列及read 1或read2标志，而BGI序列名称有自己的特色。
• 第2行是序列，由大写"ACGTN" 组成;
• 第3行是序列ID,也有省略了ID名称后直接用"+"表示;
• 第4行是序列的测序质量，每个字母对应第2行每个碱基;

Survey测序数据质量值说明:

Survey测序数据质量值说明

• 一般Q大于20则表示碱基质量还可以

3.质控流程

质控流程

3.1、质控：软件trimmomatic

• 推荐使用conda安装，或按上面的连接安装

conda install -c bioconda trimmomatic -y

• 使用方法

trimmomatic PE -threads 8 \
./${name}_1.fastq.gz ./${name}_2.fastq.gz \
./cleanData/${name}_1.clean.fq.gz ./dropData/${name}_1.drop.fq.gz \
./cleanData/${name}_2.clean.fq.gz ./dropData/${name}_2.drop.fq.gz \
HEADCROP:10 LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:35

• 参数说明
  trimmomatic参数说明

3.2、质检：软件fastqc

• 推荐使用conda安装，或按上面的连接安装

conda install -c bioconda fastqc -y

• 使用方法

fastqc -t 8 -o ../qcReport $filename

• 质检结果说明

3.3、NT比对：软件BLAST

• NT库：非常全面的核酸数据库（https://ftp.ncbi.nih.gov/blast/db/FASTA）
  

  NT库

• 由于用所有reads去往NT库中比对太浪费时间，因此，可以提取各fa文件中前10000条reads作为比对query，由于是压缩格式所以使用zcat。

zcat ${name}_1.clean.fq.gz|head -40000 > reads.fa

• 下载好上面114G的nt库后开始比对

blastn \
-query reads.fa \
-db /你下载nt库的路径/nt \
-out reads.csv \
-outfmt "10 evalue length qseqid qlen qstart qend sacc slen sstart send pident nident sstrand qcovs qseq sseq sgi stitle" \
-num_threads 4 -evalue 1e-5 -max_target_seqs 1

• NT比对结果文件统计
  NT比对结果文件统计

4.总结

• 为什么要做qc?
  因为实验过程不可知，物种特性难量化，数据通过qc,可以做到量化展示数据，从数据分析相关信息,同时为后续Kmer分析做准备，获取一个准确的基因组预估情况。
• qc结果和NT结果需要重视哪些部分?
  污染问题最重要，数据报告上面如果出现测序质量低，测序效果不好，往往从展示图可以明确看到,但是污染的问题有可能是共生菌，细胞器，实验污染,样本污染,这些信息不仅仅是从NT比对和gc峰了解，更要结合物种特性来展开连锁分析。比如一些带病昆虫会有共生菌, 一些哺乳动物也有相关细菌。