Identification of functional pathways and molecular signatures in neuroendocrine neoplasms by multi-omics analysis
通过多组学分析识别神经内分泌肿瘤的功能通路和分子特征
发表期刊：J Transl Med
发表日期：2022 Jul 6
DOI: 10.1186/s12967-022-03511-7
一、背景
神经内分泌肿瘤（NENs）是一类罕见的、异质性的肿瘤，其分子发病机制是一个未解决的问题。NENs的特点是全身分布，因为它们由神经内分泌系统细胞发展而来，分布于全身。这些肿瘤既可以以散发性形式发生，也可以在遗传性综合征中发生。源自胰腺和胃肠道的NENs，即胃肠胰腺NENs（GEP-NENs）是最常见的形式之一。
一般来说，NENs的特点是生长速度相对缓慢，能够分泌肽类激素和生物胺，被用作生物标志物。然而，由于非特异性症状和缺乏早期标志物，许多NENs在诊断时显示出转移的特征，使得有时无法确定肿瘤病变的主要部位。除了更准确的分类外，另一个问题是缺乏诊断NEN的特异性标志物。
二、材料与方法
1.数据来源
1）46名NEN患者（甲状腺=17，胰腺=14，肠道=12，肺=3）的肿瘤活体组织
2）从帕多瓦大学医学系（DIMED）的内分泌科获得了20个先前从MTCs（甲状腺髓样癌）分离的RNA的验证集
3）为了在液体活检中验证miRNA，获得了42名NEN患者（6名MTCs和36名GEP-NENs）和34名健康受试者的血清
2.实验流程
1） 核酸提取、突变分析、阵列-CGH分析
2） 转录组分析、small-RNA分析
3） 血清采样、RNA提取、反转录和实时PCR
三、实验结果
01 - 样本选择、组织形态学特征和免疫染色
本研究分析的患者队列由66个样本组成，包括29个不同等级的GEP-NENs和37个MTCs。其中，46个是冷冻组织或FFPE，用于不同的检测，而20个先前分离的RNA样本代表了MTC转录组学的验证组。此外，对于5个GEP-NENs，作者没有获得原发肿瘤，而是有转移组织（2个肝脏和3个淋巴）。作者应用多组学实验方法来确定改变的基因、编码转录物和miRNAs，特别是影响所研究的NENs的功能途径。
在可能的情况下，根据可用样本的质量和数量，作者进行了多基因小组测序：RNA-Seq和smallRNa-Seq。对于较小的集合（30个样本），还通过比较基因组学杂交（CGH）阵列进行了分子核型。根据新的组织病理学分类，基于肿瘤分级和细胞分化，将样本分为G1-G2 GEP-NETs、G3 GEP-NECs和MTCs（图1A, D, G, L）。此外还验证了CgA和Syn免疫组化标记物的阳性染色，这些标记物用于常规组织病理学诊断，以确认NENs的肿瘤类别（图1B，E，H，C，F，I），以及CgA和Calcitonin的阳性染色，MTC的特异性免疫组化标记物（图1M，N）。在图1中，显示了上述形态学和组织病理学特征的代表性图像。聚类分析是为了评估在比较FFPE和新鲜/冷冻组织时可能出现的样本变异，显示样本最好根据组织类型分组，而不是根据样本储存和文库制备方法。然而，所有这些变异来源在下游分析中都被考虑到了。
02 - 评估NENs的多基因突变特征
通过NGS分析从46个冷冻或FFPE NEN-组织中分离出来的DNA，以确定523个癌症相关组织中更可能受序列变异影响的基因。测序后，由于质量低，两个样本被丢弃，无法进行进一步分析。详细来说，该方法可以同时分析来自不同肿瘤组织的多种生物标志物，在一次检测中评估多种变异类型，包括小核苷酸变异（SNVs）、插入、剪接变异和新兴的免疫疗法生物标志物，如肿瘤突变负担（TMB）和微卫星不稳定性（MSI）。
在对变体进行注释并过滤掉同义变体、基因间变体、覆盖率低于100倍的变体、在普通人群中存在超过5%的变体以及在ClinVar数据库中被注释为 "良性 "或"可能良性 "的变体后，作者确定了5047个突变体。其中大多数是内含子，而近18%是外含子（图2A）；仅考虑外含子和剪接变体，超过80%是非同义的SNVs（图2B）。在图2C中列出了所有被检查的NENs中前20个突变的基因，只考虑外显子和剪接变体。有趣的是，在所分析的各种组织中，最频繁突变的基因是DNA损伤检查点蛋白1（MDC1）的介质。这是一个关键的DNA损伤反应（DDR）效应器，通过与TP53相互作用发挥抗凋亡因子的作用，TP53的丢失通常与基因组不稳定性和致瘤性有关。尽管它在同源重组修复中起着关键作用，也包括其他因素，如ATM和BRCA1，这些都是分析样本中最主要的突变基因，但迄今为止，它在NENs中从未被发现有明显改变，尽管它在癌症发展和治疗中的作用正在出现。另一个证据是，与其他大多数基因不同，MDC1在每个样本中大多受到多个变体的影响，这一趋势在NUTM1、ZFHX3和FAT1中较少出现。其余的基因在单个病例中也观察到类似的行为，相反，错义突变最常在全球范围内观察到，而帧移插入或缺失和帧内缺失是零星的事件。
然后，尽管考虑了所有的NEN样本，但在前20个突变基因中，NUTM1、ERCC4、MAP3K1、MAP3K4、RET和RPS6KB2与其他基因不同，从未在肠道组织中发生突变，而仅在甲状腺和胰腺衍生的肿瘤中发生突变（图2C）。另一方面，考虑到MTC和GEP-NENs的独立情况（图S1），在最主要的突变基因中检索到已知的驱动因素和侵略性标记，如MTC的HRAS和RET（图S1A），GEP-NETs的MEN 1（图S1B），GEP-NECs的RB1和TP53（图S1C）。
对突变基因进行的功能注释分析证实，正如预期的那样，这些基因参与了与基因组稳定性维持有关的途径，如通过同源重组进行DNA修复，DNA损伤反应和检查点调节以及ATM信号传导（图2D）。最后，在分析TMB状态时，考虑到GEP-NEN和MTC组，中位数约为3；当分别考虑NETs和NECs时，在GEP-NEN组内，NECs的中位数明显增加，在某些情况下超过10，这是预测受试者对免疫疗法有反应的阈值（图2E）。相反，MSI定量评分并不具有信息量，这与其他人的观察一致。
上述44个分析样本中的30个样本的DNA也通过CGH阵列进行了分子核型分析，以评估CNVs的存在。GEP-NENs一般呈现多个缺失/重复和几个镶嵌，染色体5、6、7、11、18、22和X主要受影响，而MTCs除了一个病例外，每个样本大多显示单一事件，主要代表缺失（图3A，B）。从先前的的多基因组合测试分析可以识别基因扩增，发现EGFR和BRAF基因都位于7号染色体上，是GEP-NEN样本中最常扩增的基因之一。而最常扩增的RPS6KB1则位于17号染色体上，仅在少数情况下导致重复（图3B）。正如所料，MTC样本没有显示基因扩增事件。
由于NGS对上述相同的样本集的总RNA进行了测序，另外还有20个只有RNA的样本，因此对数据进行了分析，以评估基因表达数据与所述扩增/缺失模式的一致性以及融合转录物的存在。关于第一点，在大多数情况下观察到DNA重排和基因数量之间有明显的对应关系。这一点在19号染色体和22号染色体上得到了缓解，在19号染色体上，扩增的患者与未扩增的样本相比，同一染色体上的基因数总体上有增加的趋势（图3C），而在22号染色体上，显示缺失的患者则出现了相反的情况（图3D）。对于第二点，根据方法中描述的过滤标准，在放弃低质量样本（66个样本中的6个）后，检测到20个融合转录物。其中大多数只在1名患者中发现，少数在2或3名患者中发现（图3A）。有趣的是，尽管MTC组织很少出现融合转录物，证实这种类型的肿瘤中染色体重排事件的频率很低，但在本研究队列中，有两名MTC患者检索到了以前在高级别浆液性卵巢癌中发现的融合物AL391840.3-SH3BGRL2。需要进一步的实验来研究这些重排在NENs发展和患者生存中的功能意义。
03 - NEN的miRNome剖析
为了研究miRNA的表达谱，试图鉴定可作为NEN生物标志物的去调控分子，进行了small-RNA-Seq，使623个miRNA在GEP-NENs和MTCs中普遍表达（图4A）。
对它们在研究样本中表达的靶mRNAs进行功能分析，发现它们参与了神经和内分泌癌症相关的途径，如多形性胶质母细胞瘤、胶质瘤和胰腺癌的信号传导，以及其他具体参与肿瘤发展和进展的途径，包括上皮粘连连接、TGF-β、PTEN和NGF信号传导（图4B）。由于缺乏配对的或独立的正常组织，不可能确定癌症样本中不同表达的编码和非编码转录产物。尽管如此，仅考虑GEP-NEN组织，作者评估了不同等级之间差异表达的miRNAs的可能证据，情况确实如此。正如其他研究小组已经假设的那样，一组miRNAs，在本研究案例中是52个，在NETs和NECs之间有明显的差异表达，其中一些似乎也能区分肿瘤等级。为了确定可能的循环NENs生物标志物，对3名患者进行了small-RNA-Seq，这些患者的组织和血清样本都是可用的；同样的组织之前进行了多组学分析。这使得两个MTC血清中的186个和176个miRNAs以及一个胰腺NET血清中的232个miRNAs得以识别；其中94%至98%的miRNAs也在相应的组织中表达。然后，考虑到在所分析的组织中表达量最大的100个miRNAs，NETs和NECs之间的差异表达，以及已发表的证据，选择了一组13个miRNAs进行验证。验证队列由MTC和GEP-NEN患者组成；前者被进一步区分为散发性或遗传性（MEN1）。对照组在年龄和性别上完全匹配，总共有34名健康对照组和42名患者；在患者中只有2名是G3 NENs，因此不可能根据分泌的miRNAs对GEP-NEN等级进行分层。具体考虑到被选定的miRNA子集靶向的mRNAs，这些都与ERK/MAPK、mTOR、HIF-1α、p53和ATM信号转导途径有关（图4C）。
其中一些途径特别是p53和ATM，也受到基因变异的影响（图2D），因此表明在 NEN 发育和进展过程中这种级联的多层次失调。如图4D所示，所有选定的miRNAs在患者中的表达量都比对照组高，其中大多数可以明显区分受肿瘤影响的人和健康受试者。另一方面，根据NEN的起源，即甲状腺（MTC）、胰腺散发性（pNEN）、胰腺家族性（MEN1）或其他（主要包括肠道和肺部NENs）对患者血清进行分组，发现一些miRNAs在特定的亚组中显著失调。具体而言，miR143-3p在MEN1和其他NEN中显着上调，miR144-3p和miR7-5p在MTC和MEN1中显着上调，miR942-5p在MEN1中显着上调（图 4E）。相反，miR-375在所有不同的亚组中均显著上调，它已经被提出作为其他癌症类型的循环生物标志物。然而，这种影响可能是由于亚组的相对规模，需要更大的病例系列来证实这些数据。
04 - 临床上可操作的路径预测
在被调查的NENs中，多组学分析揭示了经常突变和重复的基因、染色体重复/缺失、融合转录物和失调的miRNAs。总的来说，考虑到这些数据，作者进行了功能分析，以突出受影响最大的路径，这些路径可能是治疗这些肿瘤的有用目标。具体而言，考虑到数据集中最频繁扩增的基因，PTEN信号是受影响最明显的（图5A），特别是胰腺NENs。此外，已知与神经内分泌肿瘤有关的NGF信号传导（图5B），包括本研究案例中一些最频繁突变的基因。另一方面，在失调的miRNA靶点中，在图5C中报告了那些明显参与HIF1α信号传导的miRNA（图5C），已知RET在MTCs中被激活。相反，考虑到受基因改变和miRNA失调影响的不同层次的途径，在那些明显富集的途径中出现了描述良好的p53和新关联的ATM信号，前者代表了治疗这类癌症的潜在新治疗目标。事实上，最后一个网络，如图5D所示，包括失调的miRNA靶点、突变的基因，其中MDM2和MDM4都是miRNA的下游靶点，在一些分析的组织中也被检索为扩增的基因，加强了可能的多层次靶向的假设。
四、结论
本研究的结果强调了NENs的一种新的分子景观，鉴定了一组可能作为NEN生物标志物研究的循环miRNA，并建议将ATM及其辅助因子作为可能的分子靶点，与目前的治疗方法相结合进行测试。