脱靶检测技术助力Cas9研究

该项研究目前主要有3个方向：

首先，是CRISPR Screen文库脱靶检测

1.应用目的:CRISPR Screen检测是基于用文库及选择机制后的细胞系进行二代测序，分析统计每一种sgRNA reads 富集数，并对不同组的sgRNA数目的增多或减少进行统计，获得与选择机制相关的基因。

2.检测的原理：以PCR产物（250-280bp）为模板，DNA模板经过末端修复和加A尾后，在片段两端分别链接接头，中间不进行PCR扩增，制备PCR-free文库，采用PE150测序策略完成测序，运用生物信息学分析方法获得每种sgRNA reads富集数，并进行组建比较分析。

3.应用方向：1）sgRNA文库筛选；2）组间sgRNA差异比较

4.CRISPR Screen 文库检测流程：PCR产物——PCR-free文库——上机测序（illumina）——数据质控——对不同处理组样本进行比对，统计sgRNA变化，绘制热图、箱线图等

其次，全基因组敲除脱靶检测

1.检测的原理：将基因组DNA经Covaris破碎仪随机打碎成长度为350bp左右的片段，经末端修复和加A尾后，再在片段两端分别链接街头，制备DNA文库，并采用PE150测序测略完成全基因组测序，通过BWA、SAMtools等分析软件获得变异信息。

2.研究的目的：可以针对CRISPR/Cas9技术进行基因敲除的样本，全基因组重测序（WGS）技术可以针对全基因组脱靶信息进行扫描，并可以对sgRNA同源序列进行统计，筛选是否在该同源区域发生脱靶，以及得到具体的编辑方式。

3.应用的方向：1）CRISPR/Cas9技术对细胞系进行编辑后，药物筛选出所得表型但靶位点未发生编辑，寻找脱靶位点2）筛选全基因组内是否存在其他脱靶位点。

4.WGS敲除脱靶检测的流程：样本的检测——DNA随机打断（350bp）——加街头——Cluster制备——测序

此外，是全基因组插入脱靶检测

1.研究目的：针对基因插入的样本，WGS技术可以针对全基因组信息进行扫描，查找外源片段的插入位点。

 2.应用方向：寻找插入位点——在基因组中随机插入一段序列，需要明确插入位置的研究。如CRISPR/Cas9敲除技术或转基因插入研究。