hello，大家好，又到了周五了，一周的收官之战，今天分享的内容有点多，涉及到很多单细胞和空间的分析方法，我们要精读并且进行深入的解析，我认为方法都很经典，而且运用的也比较好，我们慢慢逐一解析，文章在Lineage-specific regulatory changes in the pathological cardiac remodeling of hypertrophy cardiomyopathy unraveled by single-nucleus RNA-seq and spatial transcriptomics ，非常棒的文章，这一次我们要详细分享。
先来一张酷炫的网络调控图
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ABSTRACT
BACKGROUND
肥厚型心肌病（HCM）是最常见的心脏遗传性疾病，具有心肌细胞肥大和心脏纤维化的组织病理学特征。 HCM 患者心肌中发生的病理重塑可能最终发展为心力衰竭和死亡。 彻底了解 HCM 病理性心脏重塑中细胞类型特异性变化对于开发成功的医学疗法以预防或减轻这种疾病的进展至关重要。
METHODS
通过对 10 名 HCM 患者和 2 名健康供体的心脏组织进行了单核 RNA-seq，并对 3 名 HCM 患者的 4 个心脏组织切片进行了空间转录组学分析。 进行比较分析以探索 HCM 患者心脏组织中表达谱、亚群组成和细胞间通讯的谱系特异性变化。 基于包括伪时间排序（轨迹分析）、差异表达分析和差异调节网络分析在内的独立分析的结果，优先考虑用于减轻 HCM 进展为心力衰竭或减轻心脏纤维化的候选治疗靶点。 使用空间转录组数据，我们检查了关键候选基因、通路和亚群的空间活动模式。（单核转录组和空间转录组的联合分析）。
RESULTS
来自 HCM 和健康条件的 55,122 个细胞核的无偏聚类揭示了 9 个细胞谱系和 28 个cluster。 观察到 HCM 中血管相关谱系的显着扩张和心肌细胞、成纤维细胞和骨髓细胞的收缩。 揭示了 HCM 中心肌细胞向衰竭状态过渡期间的转录组动力学。 获得了用于减轻 HCM 进展为心力衰竭的候选靶基因，例如 FGF12、IL31RA、BDNF、S100A1、CRYAB 和 PROS1。 还揭示了成纤维细胞活化背后的转录组动力学，并获得了减轻 HCM 心脏纤维化的候选靶标，例如 RUNX1、MEOX1、AEBP1、LEF1 和 NRXN3 。
CONCLUSIONS
对 HCM 中特定于谱系的regulatory changes进行了全面分析。 文章的分析确定了大量候选治疗靶基因和途径，以预防或减轻 HCM 的病理重塑。 用到的数据集构成了一种宝贵的资源，可以在单核和空间分辨率下检查 HCM 的谱系特异性表达变化。
INTRODUCTION
肥厚型心肌病 (HCM) 是最常见的心脏遗传疾病，估计患病率最低为 200 分之一。 HCM 也是年轻人心脏猝死 (SCD) 的主要原因，占年轻运动员 SCD 的 36%。 HCM 的特征是在没有其他心脏或全身疾病的情况下左心室壁厚度增加。 HCM 的主要组织病理学特征包括心肌细胞肥大和紊乱以及心脏纤维化。病理性心脏重构发生在 HCM 患者的心肌中，表现为心肌细胞功能障碍、成纤维细胞活化（纤维化）增加、慢性炎症和细胞死亡。如果不及时治疗，病理重塑可能最终导致不良事件，包括心力衰竭、心律失常和死亡。近年来，已经为设计 HCM 治疗剂做出了重大努力，例如，用于抑制心肌肌球蛋白 ATP 酶的 MYK-461。彻底了解 HCM 病理性心脏重塑中的细胞和分子变化对于开发成功的医学疗法以预防或减轻这种疾病的进展至关重要。
HCM 心脏组织的转录组学改变先前已通过大量 RNA-seq 在组织水平上进行了检查。 然而，无法从大量数据中获得细胞类型特异性变化。单细胞或单核 RNA-seq (snRNA-seq) 可以克服这一限制，并允许以前所未有的分辨率对细胞变化进行无偏见的剖析。鉴于成人心肌细胞的体积较大，snRNA-seq 已成功应用于解剖健康和患病条件下成人心脏的异质性，例如心肌梗塞。 然而，仍然缺乏探索转录组变化的研究HCM 的单核分辨率。最近出现的空间分辨转录组学通过提供在单细胞/核数据中丢失的表达空间信息，极大地扩展了我们理解疾病细胞机制的范围和能力。 snRNA-seq 和空间转录组数据的综合分析将深刻提高我们对疾病发病机制的认识。
在这项研究中，研究对 HCM 患者和健康供体的心脏组织进行了 snRNA-seq。还对 HCM 患者的心脏组织切片进行了空间转录组学分析。进行比较分析以探索 HCM 患者心脏组织中表达谱、亚群组成和细胞间通讯的谱系特异性变化。分析确定了 HCM 心肌细胞向衰竭状态过渡期间的转录组动力学，并优先考虑了用于减轻 HCM 心力衰竭进展的候选治疗靶基因，例如 FGF12、IL31RA、BDNF、S100A1、CRYAB 和 PROS1。还重建了成纤维细胞活化的轨迹，并优先考虑了减轻 HCM 中心脏纤维化的候选目标，例如 RUNX1、MEOX1、AEBP1、LEF1 和 NRXN3。分析提供了大量候选靶基因和通路，用于设计治疗药物以预防或减轻 HCM 的病理重塑。
RESULTS
Single-nucleus and spatial transcriptomic sequencing of the cardiac IVS tissues from HCM patients and healthy donors
如图 ，
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收集了接受手术心肌切除术的 HCM 患者的心脏 IVS 组织用于 snRNA-seq（n=10；10 个样本）和空间转录组学分析（n=3；4 个组织切片，其中 HCM1220B 和 HCM1220C 是来自同一患者）。作为对照组（简称HEALTHY），来自心脏移植健康供体的心脏IVS组织（n=2；3个样本，其中HEALTHY1A和HEALTHY1B来自同一供体）也进行snRNA-seq。对照组与 HCM 组（中国人，男性）在种族和性别上匹配。入组受试者的详细人口统计学和临床信息见数据补充表 I。质量控制后，共获得 55,122 个细胞核（HCM：39,183；健康：15,939）（数据补充中的表 II）。对于空间转录组数据，在四个切片上检测到 3,339 至 4,849 个点位于组织上方。
Significant expansion of vascular-related lineages and contraction of cardiomyocytes, fibroblasts and myeloid cells in HCM
基于为每个谱系建立的标记的表达，如图
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通过来自两种条件的 snRNA-seq 数据的联合聚类，共鉴定了 9 种细胞类型：血管内皮细胞（vEC，由 VWF 标记），成纤维细胞（FB，由 PDGFRA 标记），心肌细胞（CM，由 TNNT2 标记）， 周细胞（KCNJ8 标记）、骨髓细胞（C1QA 标记）、平滑肌细胞（SMC，MYH11 标记）、淋巴细胞（IL7R 标记）、神经元细胞（NRXN1 标记）和淋巴管内皮细胞（lEC，标记为 MYH11） MMRN1)。 通过比较两种条件下 UMAP 空间中的细胞核密度，可以发现 HCM 中细胞类型的相对比例发生了显着变化，特别是对于 vEC、周细胞和心肌细胞 （细胞marker我们做研究的有必要收集一下，下面的图如何绘制，大家可以参考我之前分享的文章密度散点图的绘制（画图基本知识））。
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接下来，我们量化了两种条件之间细胞组成的变化（这个是很常见的单细胞分析思路）
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为了确定这些变化是否是偶然的，进行了基于排列的统计检验（差异比例分析；DPA）。血管相关谱系包括 vEC、周细胞和 SMC 显着扩大（P 值 < 0.05，DPA 测试），这与 HCM 中血管生成增加的知识一致。 心肌细胞、成纤维细胞和骨髓细胞显着收缩（P 值 < 0.05，DPA 测试），这可能反映了 HCM 中细胞死亡的增加。
下图显示了每个谱系的不同分子特征。
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Cardiomyocyte-specific regulatory changes in the pathological cardiac remodeling of HCM
无偏聚类将心肌细胞分为两个亚群：CM1 和 CM2（下图，这个聚类结果其实挺差的，一般条件下认为这样的结果是不对的，但是，我们不能主观臆断）
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CM2 表达高水平的maladaptive markers，表明胎儿基因程序的重新激活，例如 NPPB（编码利钠肽 B，一种临床上用于心力衰竭的生物标志物）和 ACTA1（编码骨骼α-肌动蛋白），因此代表了心肌细胞的衰竭状态
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CM1 表达高水平的 FGF12 和 CORIN，这可能代表处于相对稳态或代偿性肥大状态的心肌细胞。 与此一致，CM2 在 HCM 中显着扩大，而 CM1 显著收缩
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接下来，使用 DEsingle（关于这个R包，大家可以参考文章2019-04-17R包DEsingle），检测了每个谱系中 HCM 与 HEALTHY 中差异表达的基因。 对于心肌细胞，2,021 个基因显着上调，486 个基因显着下调（log2 倍数变化的绝对值 >1，调整后的 P 值 < 0.05）。 In agreement with the pathological hypertrophy phenotype of HCM, the upregulated genes were enriched for terms associated with cell growth and protein synthesis (e.g., “Ribosome assembly” and “Translation”), energy metabolism (e.g., “Oxidative phosphorylation”), stress response (e.g., “Cellular responses to stress”), immune response (e.g., “Antigen processing and presentation”), cell death (e.g., “Regulation of programmed cell death”), metabolic reprogramming (e.g., “Organonitrogen compound metabolic process”), as well as contraction(e.g., “Cardiac muscle contraction”;）
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通过基因集富集分析 (GSEA) 进一步探索了每个谱系中失调的通路，通过在通路水平上稳健地检测一致差异来促进生物学解释。
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如上图所示，除了上述通过功能富集分析确定的通路外，GSEA分析揭示了更多在 HCM 心肌细胞中上调的通路，例如，“NOTCH2 激活和信号传递到细胞核”，这支持了心肌肥厚中的 NOTCH 信号传导。此外，使用 bigScale2 （bigScale2也是一个处理单细胞数据的软件,不过方法有点老，大家可以参考文章科学家开发出对单细胞进行大规模分析的新型工具—BigSCale（2））中实现的方法，针对每个条件分别构建每个谱系的基因调控网络 (GRN)。对每个谱系进行 HCM 和 HEALTHY 之间 GRN 的比较分析（差异调节网络分析；DRN 分析），并根据中心性的变化对基因进行排序，即 GRN 中的生物学重要性。分析显示了两种条件下心肌细胞的 GRN，鉴定并标记了中心性变化很大的代表性基因，如 CRYAB（Crystallin Alpha B）、EIF1（真核翻译起始因子 1）、S100A1（S100 钙结合）蛋白 A1)、PROS1（蛋白 S）、TGFB2（转化生长因子 Beta 2）和 CREB5（CAMP 响应元件结合蛋白 5）。
Transcriptomic dynamics during the transition towards the failing state of cardiomyocytes in HCM
为了破译心肌细胞向衰竭状态过渡期间的转录组动力学并确定减轻 HCM 心力衰竭进展的潜在目标，我们使用 Slingshot 通过心肌细胞核的伪时间排序重建了轨迹 （Slingshot是一个做单细胞轨迹分析的软件，但是软件相对较老，大家可以参考文章单细胞轨迹（拟时间）分析软件方法选择指导原则）
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CM2的衰竭心肌细胞在相对较晚的假时间排序
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两种条件的伪时间分布存在显着差异（这个地方还是要提醒大家一下，但细胞轨迹分析并不是把样本都整合起来分析更好，不同条件下分开样本进行分析更能体现出轨迹差异，结果更好）
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然后，使用tradeSeq，沿着两种条件之间的轨迹具有显着不同表达模式的基因被识别并聚类为7个基因cluster（这个方法类似于monocle2的轨迹分化热图）
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值得注意的是，适应不良标记 NPPB 和 NPPA 位于最后一个基因cluster (VII) 内。 接下来，根据三个独立分析的结果对候选靶基因进行优先排序，包括沿轨迹表达模式的差异（调整后的 P 值 < 0.05）、条件之间表达水平的倍数变化（log2 的绝对值） 倍数变化 > 1)，以及 GRN 的中心性变化（DRN 等级 < 1000）。 仅考虑编码转录因子 (TF)、配体和受体的基因。
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上图显示了优先考虑的 14 个候选基因。 对于大多数基因，以前尚未认识到在 HCM 中心肌细胞向衰竭状态转变中的作用，例如 FGF12（成纤维细胞生长因子 12）、CREB5、BDNF（脑源性神经营养因子）、IL31RA（白细胞介素 31 受体 A )、NRXN3 (neurexin 3)、TGFB2 和 PROS1 (下图)。
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- 注：Smoothed expression curves of representative candidate targets along the trajectory in both conditions.
Notably, some of them, e.g., FGF12, IL31RA and PROS1 were significantly upregulated in the cardiac tissues of HCM (q-value < 0.05) according to the results of bulk RNA-seq previously performed by our lab, further reflecting their roles in the pathogenesis of HCM.
Fibroblast-specific regulatory changes in the pathological cardiac remodeling of HCM
通过无偏聚类确定了四个成纤维细胞亚群：KCNMB2highFB1、NRXN3highFB2、 CNTNAP2highFB3 和 CD55highFB4
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值得注意的是，FB2 表达了最高水平的活化成纤维细胞（以前称为肌成纤维细胞）的标志物，例如 CCN2、FN1、COL1A1、COL3A1 和 MYH10，因此代表了成纤维细胞的活化状态。 层次聚类揭示了 FB1 和 FB2 之间的密切关系
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因此FB1可能代表静止的成纤维细胞状态。 与此一致，FB2 显着扩大，而 FB1 在 HCM 与 HEALTHY 中显著收缩
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接下来，检测两种条件下成纤维细胞中差异表达的基因。与 HCM 中发生的纤维化一致，纤维化相关terms，如“细胞外基质组织”和“细胞对转化生长因子 β 刺激的反应”在上调基因中富集。
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此外，上调基因还丰富了与蛋白质翻译和加工、能量代谢、应激反应以及免疫反应相关的terms。值得注意的是，Hedgehog signaling和 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 信号也得到了丰富，这与它们在其他组织和疾病条件下已知的纤维发生中的作用一致。此外，GSEA 揭示了更全面的在 HCM 成纤维细胞中上调的信号通路列表，包括经典的促纤维化信号通路（例如，“TGF BETA 信号通路”和“WNT 信号通路”）和细胞表面 ECM 受体通路（例如，“ SYNDECAN 1 途径”和“INTEGRIN A4B1 途径”）。此外，通过DRN分析检测到的中心性变化较大的前5个基因包括ADAM19（ADAM金属肽酶结构域19）、RUNX1（RUNX家族转录因子1）、CTIF（帽结合复合物依赖性翻译起始因子）、MEOX1（mesenchyme homeobox 1) 和 FGF7
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Transcriptomic dynamics during the activation of fibroblasts in HCM
为了破译成纤维细胞活化过程中的转录组动力学并确定减轻 HCM 心脏纤维化的候选治疗靶点，我们通过 FB1 和 FB2 细胞核的伪时间排序重建了成纤维细胞活化的轨迹
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活化的成纤维细胞 FB2 排列在轨迹的末端
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HCM 成纤维细胞的伪时间分布与 HEALTHY 显着不同
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接下来，沿着两种条件之间的轨迹表现出显着不同表达模式的基因被识别并聚类为7个基因cluster
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然后，我们根据上述标准对候选目标基因进行优先排序。 下图显示了优先考虑的 28 个候选基因。
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值得注意的是，排名靠前的候选基因包括 TF 基因，例如 RUNX1、MEOX1、LEF1（淋巴增强子结合因子 1）和 AEBP1（AE 结合蛋白 1），它们在 HCM 与 HEALTHY 中沿成纤维细胞活化的轨迹显着上调
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此外，bulk RNA-seq的结果表明，一些基因，如AEBP1、LEF1、NRXN3和GLIS1，在HCM的心脏组织中显着上调，进一步反映了它们在HCM发病机制中的作用。
The subpopulations of the immune and vascular lineages and their proportional changes in HCM（免疫细胞）
Unbiased clustering revealed 8 immune subpopulations（聚类图都挺丑的）
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The subpopulations immune_c0, c1, c4, c5 and c6 expressed high levels of CD68
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thus representing five subpopulations of macrophages (which were referred to as MAC1-5 hereafter).
As shown in 下图, FGF13high MAC1 and IGSF21high MAC2 expressed high levels of LYVE1, which marked for vessel-associated resident macrophages with M2-like phenotypes.
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MAC5 表达高水平的 FCN1，这标志着促炎巨噬细胞。Differential proportional analysis显示 MAC2 显着扩张和 MAC1 收缩（下图；P 值 234 < 0.05，DPA 测试），因此 MAC2 代表了一种更活跃的状态compared to MAC1。
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功能富集分析和 GSEA 都支持 HCM 中巨噬细胞的免疫激活。 除了一小簇 B 细胞核（由 CD79A 标记）外，还鉴定了另外两个密切相关的淋巴谱系亚群：immune_c2 和 Immuno_c3。 Immune_c2 表达高水平的 T 细胞标志物 CD3D 并表现出高幼稚评分，因此代表幼稚 T 细胞的细胞核。 Immune_c3 表达高水平的 T 细胞标志物 CD3D 和自然杀伤 (NK) 细胞标志物 NCR1，并表现出高细胞毒性评分，因此代表效应 T/NK 细胞核的混合物。 正如分析的那样，我们观察到效应 T/NK 核的显着扩张和naive T 核的显着收缩。
对于 vEC 谱系，确定了在 UMAP 空间中连续对齐的 7 个亚群
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从 UMAP1 的左到右，根据建立的标记，亚群被分配到动脉 ECs（以 SEMA3G 和 DLL4 为标记；动脉 EC2 和动脉 EC1）、毛细血管 ECs（以 RGCC 和 CA4 标记；capEC3、capEC1、免疫 EC 和 capEC2）和静脉 EC（由 ACKR1 和 NR2F2 标记；venousEC）。
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除 capEC1 和 venousEC 外，大多数亚群均出现显着扩张（P 值 < 0.05，DPA 测试）
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对于 SMC，鉴定出具有不同表达谱的两个亚群：SMC1 和 SMC2
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与 SMC1 相比，SMC2 表达较低水平的收缩标记，如 CNN1 和 TAGLN，并且与 UMAP 空间中的pericytes紧密对齐。
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这些结果表明 SMC2 可能代表了在 HCM 中大大扩张的小血管系统的血管 SMC。 与此一致，观察到 SMC2 的显着扩展
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对于周细胞，确定了三个亚群：pericyte1、pericyte2 和 pericyte3，观察到 pericyte2 的扩展。
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基于 UMAP 空间的排列，亚群 pericyte2 与 SMCs 密切相关，这可能代表了毛细血管周围具有较大口径的周细胞。值得注意的是，就像在心肌细胞和成纤维细胞中观察到的一样，能量代谢和免疫反应相关通路在所有三种细胞类型中都被上调。
Intercellular communication changes in the cardiac tissue of HCM inferred from the snRNA-seq data（细胞交流）
迄今为止，HCM 中的细胞间相互作用主要通过共培养实验在体外进行表征。 基于 snRNA-seq 数据，CellChat （关于CellChat分析细胞通讯，大家可以参考我之前分享的文章10X单细胞（10X空间转录组）通讯分析之CellChat、10X单细胞（10X空间转录组）通讯分析CellChat之多样本通讯差异分析）用于分别推断每个条件下体内亚群之间的配体-受体相互作用。 通过模式识别方法，针对每种条件检测到每个亚群的主要传入和传出信号模式，属于同一谱系的亚群具有更多相似的模式。 HCM 中推断的相互作用总数和强度显着增加，反映了在其他疾病中报道的疾病条件下细胞间通讯的增强。
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成纤维细胞亚群的传出和传入信号的相互作用数量和强度都有很大增加，反映了它们在 HCM 病理重塑中的核心作用。
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值得注意的是，神经元细胞表现出来自其他谱系（例如成纤维细胞）的显着增强的传入信号。 值得注意的是，心肌细胞，尤其是失败的 CM2 亚群，表现出与自身（自分泌）和其他一些谱系（旁分泌）（例如巨噬细胞）的交流减少（下图）。
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接下来，我们比较了两种条件下每个信号通路的相对信息流，并确定了在 HCM 中大大增强的通路（例如，PTN、ITGB2、CSF、PROS、ICAM、CD46、TGFb、MHC-1、ESAM 和 WNT）或特定于 HCM 条件（例如，PARs、ANGPTL 和 SPP1）。
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通过推断通信网络的联合流形学习，基于功能相似性对信号通路进行分组
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学习联合流形中每条通路的欧几里德距离反映了两种条件之间相似的功能变化。 如下图所示，距离最大的通路是 TGFb 通路。
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与此一致，网络中心性分析证实，HCM 中发送方和接收方的 TGFb 通路发生了很大变化
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the top sender从 HEALTHY 中的 MAC2 更改为 HCM 中的效应 T/NK 细胞， the top receiver从 CM1 更改为 MAC3。 然后，我们发现 TGFB1-(TGFBR1+TGFBR2) 是对 HCM 心脏组织中 TGFb 信号传导网络贡献最大的配体-受体对
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如下图展示，HCM 中 TGFB1-(TGFBR1+TGFBR2) 信号增强，成纤维细胞、心肌细胞和 vEC 接收的 TGFB1 旁分泌信号主要由效应 T/NK 细胞、初始 T 细胞和促炎巨噬细胞 MAC5 分泌。
这里我们要总结一下单细胞做细胞通讯的注意点：
1、首先关注细胞通讯配受体对的数量变化
2、相同配受体配的强度变化
3、通讯的大类划分
4、配受体对之间的距离
5、信号流
Spatially resolved examination of the expression of candidate genes, the activity of HCM-associated pathways and subpopulations by spatial transcriptomics.(空间转录组的分析)
选择用于空间转录组学分析的四个组织切片包含具有替代性纤维化和/或弥漫性（间质或血管周围）纤维化的区域，这些区域通常发生在 HCM 中。 HCM1225D 部分的特点是大的替代性纤维化疤痕和间质纤维化
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对于 HCM1221A 部分，间质纤维化仅限于靠近心内膜的相对狭窄区域，而大多数区域代表非纤维化心脏组织。 HCM1220B 和 HCM1220C 切片的特点是广泛的弥漫性纤维化。 通过斑点的无偏聚类，可以将纤维化区域的spot与非纤维化区域的spot分开。 例如，clusterSC0 和 SC1 通常分别代表 HCM1225D 切片上纤维化和非纤维化区域的spot。（空间数据也是要聚类的）
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同样，其他切片的纤维化和非纤维化斑点簇也被识别出来。 遵循 Seurat 的标签转移工作流程，我们整合了 snRNA-seq 数据和空间转录组数据。 CM1 是处于稳态或代偿性肥大状态（以 FGF12 为标志）的心肌细胞亚群，预计定位于非纤维化区域，而 CM2，处于衰竭状态的心肌细胞亚群（以 NPPB 为标志）定位于靠近 纤维化区域。
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FB1，静止的成纤维细胞亚群，主要位于非纤维化区域，而 FB2，激活的成纤维细胞亚群，位于 309 个纤维化区域。候选靶基因AEBP1、RUNX1、MEOX1和MGP在纤维化区域高表达。因此，空间转录组数据证实了我们上述 snRNA-seq 分析的结果。 接下来，针对每个切片分别鉴定纤维化与非纤维化区域中失调的基因和途径。如下图所示，上调的通路主要参与 ECM 重塑（例如，“REACTOME_EXTRACELLULAR_MATRIX_ORGANIZATION”和“REACTOME_TRANSLATION”）、纤维化相关信号（例如，“KEGG_TGF_BETA_SIGNALING_PATHWAY”和“WP_PI3KAKTWAYING_SIGNALING_SIGNALING_SIGNALING”，免疫反应等） ”和“WP_IL18_SIGNALING PATHWAY”），而下调的通路主要涉及收缩（例如，“KEGG_CARDIAC_MUSCLE_CONTRACTION”）、能量代谢（例如，“KEGG_OXIDATIVE PHOSPHORYLATION”）和 TP53 介导的应激反应（例如，“REACTOME_TRANSULCRIPTIONAL”）。
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下图表明代表性上调途径在纤维化区域表现出高表达活性。
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DISCUSSION
了解疾病条件下的监管变化对于成功的药物开发至关重要。 通过使用 snRNA-seq 和空间转录组学分析，本研究首次全面分析了人类 HCM 患者心脏组织中表达谱、亚群组成和细胞间通讯的谱系特异性变化。 我们基于多个独立分析优先考虑的候选基因可以作为治疗靶点，以预防或减轻 HCM 的病理重塑。
虽然心脏重塑是由多个谱系精心策划的，但心肌细胞是心脏病最重要的决定因素。因此，直接针对心肌细胞的药物治疗可能是缓解 HCM 病理性肥大或减轻心力衰竭进展的最有希望的策略。单核分辨率数据使我们能够检查体内 HCM 的心肌细胞特异性调节变化。功能富集分析和 GSEA 的结果很好地概括了病理性心脏肥大的已知特征，包括蛋白质翻译增加、能量代谢、应激反应、免疫反应、细胞死亡和收缩。在通过 DRN 分析中心性发生很大变化的基因中，一些与心脏肥大或心力衰竭有关；例如，CRYAB (Crystallin Alpha B) 已被证明可抑制小鼠压力超负荷 340 诱导的心脏肥大。 S100A1（S100 钙结合蛋白 A1）已被建议作为治疗心力衰竭的靶点。然而，精确的大多数基因在 HCM 的发病机制中的作用尚未阐明，例如 PROS1 (Protein S) 和 CREB5。心肌细胞分为两个亚群：CM1 和 CM2，分别代表稳态或代偿性肥大状态和衰竭状态。通过空间转录组学发现衰竭的心肌细胞亚群 CM2 靠近纤维化区域，这反映了心脏纤维化对 HCM 心肌细胞的不利影响。细胞间通讯分析显示，心肌细胞，尤其是失败的亚群 CM2，在 HCM 中表现出与自身（自分泌）和其他一些谱系（旁分泌）的通讯减少，反映了 HCM 中心肌细胞的通讯功能障碍。
病理性心脏肥大是心力衰竭的常见前身。 最近的一项研究报道了压力超负荷诱导的小鼠模型中心脏重构的早期（肥大心肌细胞）和适应不良的噬菌体（衰竭心肌细胞）之间心肌细胞的转录组差异，通过伪时间排序，我们确定了人类患者 HCM 心肌细胞向衰竭状态过渡期间的转录组动力学。基于来自独立分析的多条证据，我们获得了一系列基因，这些基因可以作为减轻 HCM 心力衰竭进展的潜在医学靶点，并且大多数基因与心力衰竭或心脏肥大（如 FGF12、IL31RA）无关, BDNF 和 PROS1。值得注意的是，FGF12（成纤维细胞生长因子 12）的表达沿着 HCM 中衰竭状态的轨迹下降。最近有报道 359 FGF12 抑制肺动脉高压中 SMC 的病理重塑。同样，我们推测它可能在 HCM 心肌细胞的病理重塑中起保护作用。
心脏纤维化是心脏组织中的瘢痕形成过程，其特征在于响应病理生理学刺激而过度沉积 ECM。 HCM患者存在高负荷的心脏纤维化，导致舒张功能障碍。心脏纤维化已被证明是 HCM 中 SCD 和心力衰竭等不良结局的独立预测因子。心脏纤维化是由成纤维细胞的活化介导的，了解 HCM 中成纤维细胞活化的调控机制对于开发有效的药物治疗以减轻心脏纤维化并从而防止 HCM 患者出现不良后果至关重要。我们确定了活化的成纤维细胞亚群 FB2，正如预期的那样，它在纤维化区域显着扩大和定位。此外，基于来自独立分析的多条证据，我们获得了用于抗纤维化医学开发的候选靶基因。其中，一些排名靠前的 TF 基因可能代表驱动 HCM 或其他纤维化相关疾病中成纤维细胞活化的关键调节因子。例如，最近有人提出 RUNX1 是心肌梗塞后心脏纤维化的关键调节因子。 最近的一项研究表明，MEOX1 调节促纤维化功能，并与包括心脏、肝脏、肺和心脏在内的多个人体器官的纤维化有关。肾 AEBP1（也称为 ACLP）与肺纤维化的成纤维细胞活化有关。然而，我们的研究还确定了一系列未明确与纤维化有关的新基因和通路。例如，LEF1 和 IL18 信号通路。有趣的是，NRXN3 编码神经蛋白家族的跨膜受体蛋白，主要在神经元中表达，主要在精神疾病中讨论，被发现在活化的成纤维细胞中高度表达，其在心脏纤维化中的确切作用值得进一步探索。
越来越多的证据表明，免疫细胞在病理性心脏重塑过程中协调心肌细胞（如肥大）和其他非心肌细胞（如成纤维细胞活化）的反应。 因此，确定与疾病相关的免疫细胞亚群并开发调节心脏免疫表型的疗法细胞代表了另一种重要的治疗策略，例如，用工程化 T 细胞靶向心脏纤维化。 （例如，T/NK 细胞）免疫。同时，发现与免疫反应相关的途径，例如抗原加工和呈递，在所有非免疫细胞类型中都被上调，反映了 HCM 中增强的免疫反应。 TGF-β 信号传导不仅在疾病中具有许多多效性作用，例如在病理性心脏重构中促进心脏肥大和纤维化，而且在组织稳态中也具有多效性。虽然 TGF-β 阻断可能是一种有前景的治疗策略，但直接和过度抑制 TGF-β 可能导致基质降解、心脏扩张和功能障碍。通过细胞间通讯分析，我们发现 TGF-β 的最高发送者从 HEALTHY 中的 MAC2 改变HCM 中的效应 T/NK 细胞，这表明抑制 T/NK 细胞的活化可以减弱 TGF-β 信号传导，从而减轻 HCM 的病理重塑，同时避免直接 TGF-β 阻断的有害影响。
在本研究中，健康组（n=2）的受试者人数少于 HCM 组（n=10）。 这可能会限制比较分析的统计能力。 将包括额外的对照样本以解决后续研究中的这一限制。 此外，在我们实验室后续功能研究的候选靶标的优先排序中，仅考虑了 TF、配体和受体； 然而，其他类型的分子，例如激酶，也可以作为药物开发的理想靶点。
总之，对 HCM 中特定于谱系的监管变化进行了全面分析。 文章的分析确定了大量候选治疗靶基因和途径，以预防或减轻 HCM 的病理重塑。 文章的数据集构成了在单核和空间分辨率下检查 HCM 细胞类型特异性表达变化的宝贵资源。
Method
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通讯分析
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单细胞空间联合分析
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生活很好，有你更好