荧光原位杂交FAQ

荧光原位杂交FAQ

1.FISH主要受哪些因素的影响？

1.         FISH受光照、温度、湿度和各种试剂的pH影响。温度和湿度直接影响探针与目标DNA的杂交效率；光照影响了荧光染料的强度，所以探针要避光保存，已经杂交的片子可用荧光淬灭剂封片且避光保存；各种试剂pH也要精确达到要求，这会直接影响FISH的稳定性。
2.      
3. 2. 荧光原位杂交的基本原理是什么[1]？
4.      FISH是一种利用荧光标记DNA探针来检测一般在常规染色体显带检查的分辨率之外的基因变异的常用技术；其原理是基于单链DNA分子的识别并结合至中期染色体或间期核中的互补序列。
5.        探针和靶DNA用热甲酰胺溶液处理，使双链DNA变性。然后，探针与靶DNA在37℃下孵育，以通过探针与靶序列互补碱基配对来退火。配备适当滤镜的荧光显微镜被用于检测目标物质上有无明显信号的杂交探针。同一目标可同时用不同颜色荧光标记的多个探针，以检测基因组的一个或多个特定区域。
6.      FISH经常在培养细胞的分裂中期染色体上进行，使探针信号直接定位到染色体上，以检测染色体的先天或获得性改变。FISH也可用于不分裂细胞的靶基因组序列，以识别细胞周期阶段无关的染色体畸变。这种技术称为间期FISH（interphase FISH，iFISH），用于多种临床标本的染色体计数和染色体重排的鉴定。
8. 3.DNA-FISH与RNA-FISH的区别？
9.       DNA-FISH和RNA-FISH都可以在同一个样本中直观显示多个标靶，并且能够重复用，前者能用荧光显微法观察，后者既能用荧光显微法观察，还能进行HCS和流式细胞分析。DNA-FISH主要应用于基因存在、拷贝数和位置识别以及突变分析；RNA-FISH主要应用于识别基因表达、RNA的时间和空间定位。
11. 4.DNA-FISh探针的主要分类和用途[2]？
12.       着丝粒探针（CSP探针）：用于检测染色体数目异常如三体、单体等；染色体臂或整条染色体涂染探针（WPP探针）：用于检测染色体易位和标记染色体；序列特异性探针（GLP探针）：包括臂、带和基因探针等多种；除此之外，还有亚端粒探针，靠近端粒的200-300Kb为染色体特异性DNA，用于检测涉及端粒的隐匿性易位。
14. 5.直标型探针和间标型探针的区别？
15.      直标探针是指DNA探针共价连接荧光素基团；间标型探针是指DNA探针先于某个半抗原连接，诸如地高辛或生物素，然后半抗原与荧光素基团连接从而形成探针-半抗原-荧光素基团，类似“三明治”的复合物。
16.       与间标探针相比，直标型探针具有低背景、高特异性的特点。随着荧光染料和荧光检测技术的不断发展，灵敏度不断提高。因而在FISH检测领域，尤其在疾病分型领域，探针大多采用直标型设计。
18. 6.外周血样本做FISH的处理过程是什么[3]？
19.      (1)使用镊子小心地揭去杂交区的盖玻片；
20.      (2)将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各一分钟以便充分地脱水。将片子风干后就可以进行重复的杂交了。二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于3分钟。如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。对于多次杂交，复染液浓度的降低有利于保持探针的亮度。也可对已经进行G带显色的样本片进行FISH操作：将样本片浸泡于70％、85％和100％的乙醇中各二分钟以便充分地脱水。将片子风干后就可以进行重复的杂交了。二次杂交中建议将变性的时间缩短一半，但不得少于3分钟。如果对同一样本还要进行三次杂交，变性的时间就无需减少了。
22. 7.荧光信号在短时间急剧衰退的原因可能是？
23.      正常情况下，杂交后的探针如果能保存适当，荧光信号能保持半年以上。出现短时间衰减的情况主要是因为操作观察过程中或是探针的保存过程中没有采取严格的避光措施。
24.       阳光或是强的灯光都会时都会使荧光染料发生急剧的淬灭，从而造成了观察结果的不确定。因此在操作和观察时，尽可能在暗室中操作，也可在封片观察时加入一定的抗淬灭剂以延缓荧光素的淬灭。
26. 8.FISH技术的优势有哪些？
27. （1）安全、快速、灵敏度高；
28. （2）探针能较长时间保存；
29. （3）多色标记，简单直观；
30. （4）可用于中期染色体及间期细胞的分析；
31. （5）可应用于新鲜、冷冻或石蜡包埋标本以及穿刺物和脱落细胞等多种物质的检测。

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