文献阅读-RALF4/19-BUPS1-ROP1信号通路维持花粉管生长过程中的细胞完整性

本次阅读的文献是近期发表在《Development cell》上的《Membrane receptor-mediated mechanotransduction maintains cell integrity during pollen tube growth within the pistil》，通讯作者是加州大学的杨贞标老师。

细胞壁的完整性对于花粉管的侵袭性生长非常重要，近年来发现的RALF4/19-ANX1/2BUSP1/2LLG2/3这条信号通路对于花粉管自身花粉细胞壁完整性的维持是必要的，而来源于胚囊的小肽RALF34可以竞争性的与受体结合，使得花粉管正常爆炸完成双受精。

目的：筛选在雌雄双方互作过程中的新因子。

方法：挑选了36个在花粉管内表达的RLK，要来T-DNA突变体进行表型观察，发现了BUSP1几乎拿不到纯合体，且在花粉和花粉管里特异表达。

遗传分析：构建了BUSP1的RNAi材料，与前面的文章报道相似，突变体在体内花粉管很难穿过引导组织，通过体外萌发发现主要是花粉管提前爆炸。

BUPS1 is required for pollen tube integrity upon emergence from the style

进一步探索遗传关系，BUSP1的下游是什么，利用EMS诱变作者筛选到了三个角果长度部分回补的突变体s s11, s22 和 s31。其中s11正反交显示是雌方的问题，但是苯胺蓝染色的结果显示，相比于野生型，在s11 中busp1的花粉管能够长到引导组织中部，类似于ntt的突变体，经鉴定发现的确是NTT的突变体。由于ntt 育性缺陷无法回补，因此只能用busp1 的花粉授给 ntt 的T-DNA mutant，发现表型与EMS诱变得到的突变体表型相似，因此这暗示着BUSP1和NTT可能存在一定关系。那么这种关系如何体现？作者提出了两种猜测：一种可能是由于NTT的遗传通路影响，另外则是NTT影响了引导组织细胞的物理特性。通过将busp1的花粉授粉给不同阶段(stage12 14)的拟南芥，其中花柱细胞状态良好，但是在stage12时是引导组织细胞没能降解，但是在stage12时花粉要长得更长，推测花粉管在穿过紧密的花柱后，WT的花粉管能够正常感知压力变小，而busp1则无法感知从而爆炸。如何证明进一步BUSP1参与压力感知呢？通过将busp1授粉给拟南芥的近缘种（花柱不降解），生长长度变长，此外在体外萌发中，busp1的花粉管穿过花柱立即爆炸。因此BUSP1与NTT之间联系很可能是物理相关的。

The in vivo growth defect in BUPS1-deficient pollen tubes is rescued by the compactness of female tissues

为了进一步阐述BUSP1与机械刺激的之间的关系，作者利用TipChip手段模拟花粉管在雌蕊中的生长状态，在通道越宽的情况下，爆炸的比例越高，暗示在BUSP1感受压力是来自于花粉管穿过柱头到花柱的过程。

In vivo rupture phenotype of amiRBUPS1-1 pollen tubes are recapitulated in microfluidic channels simulating the pollen tube growth paths in pistils

那么BUSP1感知这种细胞压力改变的呢？两种假设，可能是预先存在改变细胞壁硬度或是对这种压力变化的感知变弱。通过在不同膨压培养基体外萌发花粉管，发现并无明显差异，因此细胞壁的硬度可能并无改变；利用多个pectin的抗体PI，OG7-13, JIM5去检测低甲酯化果胶以及JIM7检测高甲酯化果胶，发现细胞壁组分并无明显影响，因此进一步推测BUSP1可能是参与细胞压力变化的感知。

利用PI染色在微通道中染去甲酯化果胶，发现在正常的野生型当中，当花粉管穿过狭小的通道时，PI密度会降低，通过后上升，但是busp1 的花粉管中穿过通道后，PI密度则不能正常恢复。因此综上作者认为BUSP1的功能很可能是参与了细胞压力的感知，并且可以通过改变果胶的组分来调节自身硬度。

BUPS1 is required for mechanical stress-induced cell wall strengthening

进一步探究BUSP1感知压力的遗传关系，先前的研究过程中发现花粉表达ROP1可以位于BUSP1的下游发挥作用，在FER的信号通路中，ROP的激活依赖于受体与ROP的激活因子RopGEF发挥作用。那么BUSP1和ROP之间关系是什么呢？通过酵母双杂，发现BUSP1可以与五个花粉管内表达的RopGEF8, 9,11, 12, 和 13存在相互作用，那么ROP1会不会被BUSP1激活呢？这里引入了ROP的reporter：GFP-tagged CRIB4，作者猜测当ROP会特异的被机械压力所诱导导致硬果胶含量的提升，预实验发现的确如此，在野生型中在用果胶酶处理条件下，GFP亮度上升，PI染色含量也上升，但是在busp1中，ROP活性下降。随后利用微通道，发现在busp1 的花粉管在穿过通道时ROP活性未出现明显降低，穿过后也未出现明显上升。通过回补pLAT52:CAROP1(RopGEF12和ROP1组成激活的突变体)，发现能够回补busp1 花粉管生长长度的缺陷，但是单独的RopGEF12或是ROP1则不能。因此BUSP1-RopGEF-ROP1信号通路可能特异性的调控花粉管压力的感知。

BUPS1 is required for the mechanical activation of ROP1 GTPase

在上游，BUSP1接收RALF4/19的小肽信号来调控细胞壁完整性，那么RALF4/19是否也参与机械压力的感知过程呢？类似的，ralf4/19 的突变体的花粉管能够在未成熟的引导组织或是T. salsuginea的引导组织中生长到底部。那么RALF4/19的分泌是否也会受到机械压力的调节呢？在野生型花粉管离开微通道的缝隙后，RALF4的分泌增加，表明机械压力促进了RALF4分泌，但在bups1花粉管中未检测到RALF4分泌的增加，暗示RLAF4/19-BUSP1可能形成一个反馈模型以维持花粉管通过缝隙后迅速变化的压力以维持细胞完整性。

RALF4/19 peptides participate in the mechanical regulation of cell wall integrity

综上所述：BUSP1可能是联系花粉管侵袭性生长和细胞壁完整性的关键纽带，在调节花粉管在穿过雌性生殖组织（从花柱到引导组织）中维持细胞壁完整性过程中发挥重要作用。

有些问题：

1.ANX1/2，LLG2/3以及MRI是否也参与到机械压力的感知

2.如何证明BUSP1是直接机械压力的sensor（文章也指出）？

3.在细胞压力增大时，力的sensor是什么。