组学知识FAQ第二弹| 代谢组知识进阶版

小易在组学知识FAQ第一弹| 代谢组知识知多少？中主要讲到了代谢组的一些常识（基础篇），那么本篇文章重点知识来罗，都是大家研究中常常遇到的问题，赶紧学起来吧！

Q11  代谢组送样过程有哪些需要注意的事项？

低温原则：在采集、处理及运输过程中，请全程保持低温；

一致性原则：在实验设计和取样的过程中，保持一致性；

(a)设计一致性， 不同样品除了需研究的内容不一致，其它都保持一致； 

(b)时间一致性，采样时间应控制在同一时间范围内；

(c)预处理一致性，即所有样品的预处理方法、试剂等均保持一致；

避免溶血：采血过程中一定要避免溶血发生，血液掺杂异物、剧烈震荡、离心转速过快等均可能导致溶血。

Q12  如何选择代谢组相关技术？

非靶向代谢组：通过对样品中所有离子峰的采集，最大程度反映生命体对外界刺激、病理生理变化以及本身基因突变而产生的体内代谢物水平的多元动态反应。

适用于没有明确的研究目标，希望比较样品中代谢物的差异，缩小研究范围的项目。
非靶向脂质组：检测存在于生物基质中的脂质以及各种刺激或干预引起的脂质的变化，分为八大类：1. 脂肪酸类（fatty acids）2. 甘油脂类（glycerolipids）3. 甘油磷脂类（glycerophospholipids）4. 鞘脂类 （sphingolipids）5. 固醇脂类（sterol lipids）6. 孕烯醇酮脂类（prenol lipids）7. 糖脂类（saccharolipids）8. 多聚乙烯类（polyketides）。研究表明很多疾病都与脂质代谢关系密切，如糖尿病、心血管疾病、肥胖、脑损伤、阿尔茨海默病（AD）和癌症等。

适用于组织细胞中脂质物质鉴定、脂质功能及代谢调控研究、脂质代谢途径及⽹络研究、脂质⽣物标志物发掘。

靶向代谢组：针对特定的代谢物进行绝对定量，检测各个样品种某种代谢的含量。以标准品为参考，对特定代谢物进行有针对性地、特异性地检测与分析，通常采用的技术为多反应监控技术（MRM)。

适用于验证非靶代谢组学实验提出的假说、基于假说进行探索性实验，针对特定化合物研究代谢物研究模型。

广泛靶向代谢组学：将非靶代谢组学高通量的优点与靶向代谢组学的高准确度、高灵敏度的优点结合起来的一种新型代谢组检测技术。采用三重四级杆+MRM扫描模式，高通量地检测某几类化合物。

适用于胁迫应答机理研究、药用植物药用成分合成机理及药物代谢研究、蔬果花卉颜色改良育种、动植物生长发育机理研究、疾病biomarker筛选、疾病发生发展机制研究、药效与毒副作用研究等。

Q13  不同类型样本该如何设置生物学重复

建议：临床样本N≥30、动物样本N≥10、细胞样本N≥6、植物样本N≥6、微生物样本N≥6。

代谢组学相较于其余组学，处于生物学过程下游位置，经过生物学过程信息层层放大，所以个体间的差异也放大。为了避免样本代谢谱个体化差异带来的分析误差，要求样本数量尽可能得多。如果生物学重复数目太少的话，后期构建模型较差，满足条件的差异代谢物会很少，只有三个生物学重复可能很难甚至没有办法进行统计学分析。

Q14  做代谢组研究每组生物学重复数一定要相同吗？

每组样本的生物学重复数目不一定要相同，但最好不要相差太多，差别不要超过三分之二即可。在一定程度上，生物学重复数足够比生物学重复一样更重要。

Q15  如何筛选差异代谢物

如果利用常用的筛选标准（VIP＞1和P＜0.05）没有找到目标差异代谢物/差异代谢物太少，首先可以将筛选阈值放宽，如VIP＞1和P＜0. 1。如果还是没有筛选出差异代谢物，那么可以对检测到的物质进行单维统计学分析，如FC>1.5和P＜0.05，通过每单个代谢物组间样本的表达值比较分析差异代谢物，并用火山图展现。

Q16  为何多组比较不能绘制火山图？

火山图主要根据 FC（Fold-change）和 p-value（统计学 p 值）来绘制，FC 的计算方法为 FC=Mean A/Mean B（比较组设置为 A vs B，则 FC 为 A 组均值与 B 组均值的比值），而三组及三组以上的比较是无法计算三个组的比值的，所以只有两两比较的组别设置中可以绘制火山图。

Q17  检测到的代谢物中存在部分物质没有KEGG数据库的ID号是怎么回事？

很多代谢物在KEGG 中没有对应的ID号，属于正常，KEGG并没有把所有的小分子代谢物都囊括进去，因此后续的差异代谢物通路富集分析主要是针对差异代谢物中有对应的KEGG ID的物质进行的。

Q18  KEGG 通路结果中为什么出现与本物种无关的通路信息？

KEGG 收录的信息虽然有一部分物种信息，根据代谢物所对应的的 KEGG ID 号进行通路查询，因此代谢物在 KEGG数据库中注释到的通路图可能会出现与非关注的物种相关的通路信息，建议结合研究背景进行筛选。

Q19  为什么非靶的结果用靶向没验证出来？

非靶代谢和靶向代谢检测是两种完全不一样的检测原理，非靶代谢主要是广谱性,通过不同色谱柱及离子化方式，尽可能采集多的代谢物离子峰，通过数据库比对鉴定差异代谢物，寻找biomarker或者不同组别之间的差异比较；靶向代谢是根据MRM(多反应监测)的方法对于目标代谢物进行定量分析和比较，匹配的是母离子/子离子对现。所以两者目的不尽相同，鉴定方法和得到的结果展示均不相同。

另外提取方法也不一致：非靶的提取方法会得到样本中的大部分代谢物，没有针对性；而靶向的话是针对某一类型的物质有专门的提取方法。

Q20  为什么通过其他技术手段检测物质A的含量明显多于物质B，但是在代谢组数据中，物质B的信号强度明显大于物质A的信号强度？

不同物质的理化性质是不同的，各自具有不同的分子结构和性质基团，因此不同物质在质谱离子化效率、信号响应强度等方面都可能是有较大的差异的，最后体现为不同物质的质谱检测效率有所区别。因此，代谢组数据仅适用于同一物质在不同状态、不同组别间的比较，不适用于同一样本内部不同物质之间量的比较。