RPKM, FPKM 和 TPM

在RNA-seq中，某一段基因区域内的read counts取决于测序的深度和基因的长度；基因越长、测序深度越深，比对到该基因所在区域的read counts数目就会相对越多。因此在比较不同样本中基因的差异表达时，首先需要对read counts数据进行标准化，即对基因长度和测序深度进行标准化。目前常用RPKM (Reads Per Kilobase Million), FPKM (Fragments Per Kilobase Million) 和 TPM (Transcripts Per Million)作为标准化数值。

RPKM (Reads Per Kilobase Million)

RPKM的计算分两步:

1. 测序深度标准化

• per million scaling factors : 每个样本中reads的总数并除以10^6
• 计算reads per million (RPM)：每个reads数除以上面得到的“per million scaling factors”，得到对应基因在每百万reads中所占比例；

2. 基因长度标准化

• RPM 除以对应基因的长度（通常是所有外显子长度的总和，以kb为单位），得到每百万reads每一千碱基对中包含的reads数，即RPKM。

FPKM (Fragments Per Kilobase Million)

FPKM与RPKM的计算过程相同，只是RPKM用于单端测序结果，FPKM用于双端测序结果。

TPM (Transcripts Per Kilobase Million)

TPM 与RPKM/FPKM的区别在于：TPM先消除基因长度的影响，再消除测序深度的影响。
其计算分两步：

1. 基因长度标准化

• 计算RPK (reads per kilobase) : 将每个read counts除以对应基因的长度（外显子区域的长度，单位为kb），得到每千个碱基对应的reads数。

2. 测序深度标准化

• per million scaling factors： 每一个样本中的RPK加起来的总数除以10^6;
• TPM: 用RPK除以“per million scaling factors”。

由计算公式可知，每一个样本中所有基因的TPM之和都等于10^6， 每个基因的均值都等于10^6/N（N为基因总数）。由于每个样本总的TPM值是相同的，这样便于样本间基因差异的比较。