2022-10-27

Nat Methods | 原位“光学测序”探索基因表达状态空间高精地图

图灵基因 2022-10-27 09:32 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学技术

Light-Seq是一种在固定细胞和组织中使用光定向DNA条形码，然后进行异地测序，对完整生物样品进行多重空间索引的方法。

Light Seq将DNA条形码的空间定向快速光交联结合到原位互补DNA上，并进行一步DNA拼接反应，以创建汇集的空间索引测序文库。这种光定向条形码能够在完整的固定组织样品中原位选择多个细胞群体，以便基于位置、形态或蛋白质染色进行全转录组测序，而无需细胞分离。

将Light Seq应用于小鼠视网膜切片，从三个细胞层中回收了数千个差异丰富的转录组，并发现了一种非常罕见的神经元亚型——多巴胺能无长突细胞的生物标记物，每个切片只有4到8个单个细胞。Light Seq提供了一个工作流程，将原位成像和蛋白质染色与同一细胞的下一代测序相结合，使样品保持完整，以便在测序后进行进一步分析。

这项工作发表在《Nature Methods》上的一篇题为“Light-Seq: Light-directed in situ barcoding of biomolecules in fixed cells and tissues for spatially indexed sequencing”的论文中。

“Light-Seq独特的功能组合填补了一个尚未满足的需求:能够对保存的组织中难以分离的细胞群或罕见细胞类型进行图像信息、空间规定、深度测序分析，并将其高度精细的基因表达状态与空间、形态和潜在疾病相关特征一一对应。”Wyss研究所的核心教师Peng Yin博士说。

此前，Yin的团队已经开发了空间转录组学方法SABER-FISH，用于直接在完整组织中对基因表达进行成像。“使用SABER-FISH，我们距离捕捉细胞完整的基因表达程序还有好几个数量级的距离，因为每个细胞都有数千个不同的RNA分子。RNA分子太密集了，用目前的成像技术无法完整捕捉到它们。”Wyss研究所Yin实验室的技术开发研究员Jocelyn Kishi博士指出，“Light-Seq通过NGS将高分辨率条形码标记与全转录组测序相结合，解决了这个问题，为我们提供了两全其美的优势和额外的关键优势。”

Yin团队的博士后Ninning Liu博士说: “为了在完整组织样本的定制选择位置对细胞进行特定的测序，我们开发了一种新的方法，用于将DNA条形码光交联到RNA分子的拷贝上，以及一种DNA纳米技术驱动的程序，使它们及其附带的RNA序列能够被NGS读取。”

首先，DNA引物与细胞中的RNA分子形成“碱基对”，并被扩展以产生cDNA。然后，含有超快光交联子核苷酸的DNA条形码链与细胞内的cDNA进行碱基配对。当一个靶细胞在显微镜下通过一种模板状的光学装置被照亮时，这些细胞就会永久地连接在一起，这种光学装置可以将显微镜下的其他非靶细胞置于黑暗中，从而使它们免受光交联反应的影响。将未在原位永久连接的细胞中的条形码DNA序列清洗后，可以用不同的条形码和光模式重复这一过程，以标记更多感兴趣的区域。

“为了能够将这种条形码工作流程与NGS集成，我们设计了一种基于DNA纳米技术的新的拼接反应。这项创新使我们能够将条形码cDNA转换为连续的读出序列。然后，我们可以从样本中提取含有条形码的cDNA序列的完整集合，并使用标准NGS技术对其进行分析。”Sinem Saka博士解释说。Sinem Saka博士目前是德国海德堡欧洲分子生物学实验室的小组组长，曾在Wyss研究所Yin实验室做博士后。“最终，每个条形码都会将完整的转录组读数追溯到组织样本中预先选择的细胞，这些细胞保持完整，以供后续分析。这为我们在测序后重新访问完全相同的细胞以进行验证或进一步探索提供了独特的机会。”

Yin的团队将Light-Seq应用于小鼠视网膜的横切面，以分析具有不同功能的三个主要层。研究人员获得了与单细胞测序方法相当的序列覆盖率，并发现视网膜三个主要层之间富集了数千个RNA。他们还表明，经过序列提取后，组织样本保持完整，可以进一步成像以检测蛋白质和其他生物分子。最后，研究小组成功分离出视网膜多巴胺能无长突细胞的完整转录组，这种罕见的细胞类型很难分离。

“我们的测序数据清楚地表明，Light-Seq可以确定RNA结构的自然变化。展望未来，我们对使用Light-Seq来更好地理解免疫系统、疾病传播细胞和不同治疗策略（如基因和细胞治疗）之间的相互作用非常感兴趣。”Kishi说，她正在与她的一些合著者一起寻求一条将Light-Seq商业化的道路。