羊驼免疫流程及技巧
一、纳米抗体的制备方法
纳米抗体也称为单域抗体，它的开发与传统单克隆抗体通过杂交瘤制备的方法不同，它一般通过免疫羊驼、构建噬菌体文库并通过噬菌体展示来筛选出纳米抗体，再通过纳米抗体表达和纯化后进行与抗原是否结合的验证实验。
单域抗体普遍通过免疫羊驼获得，羊驼体内免疫系统自身的抗体成熟后，分离B淋巴细胞，提取RNA，反转录获取cDNA，以cDNA为底物PCR扩增获取多样化纳米抗体基因片段，然后将多样化纳米抗体基因片段连接到噬菌粒上，构建噬菌体库，并通过噬菌体展示筛选技术得到适合的抗体，对纳米抗体进行验证。整个流程主要包括羊驼免疫、噬菌体文库构建、抗体筛选、表达纯化及验证[1]。
二、纳米抗体的制备流程：
2.1 羊驼免疫流程
（1）准备抗原：一只羊驼可以同时免疫1-3个抗原，每次免疫总的抗原量保持在1-2mg之间，体积在2mL以下，免疫前将抗原和佐剂1：1乳化使其形成均匀混合物，4℃保存。
（2）免疫羊驼：记录空白羊驼耳号后开始免疫实验。注射于羊驼颈部淋巴结附近左右两侧，每侧注射2点，每点注射约0.4mL乳化好的抗原。免疫后观察半小时确认羊驼无不适症状。每2周免疫一次，至少进行4次免疫。
（3）采血：4次免疫过5-7天后，从羊驼颈部静脉进行采血50ml。
（4）血清分离：每次抗原免疫前进行采血用于免疫评价，每次取5mL血液；血液当天使用预冷25℃离心机，400 xg离心30分钟，分离保存上层血清，用于后续抗体效价检测。
（5）分离淋巴细胞：先加入15mL细胞分离液，再缓慢加入15mL血液到50mL的离心管。加入血液时小心缓慢以防止血液和分离液混匀。25℃预冷离心机，400 xg离心30分钟，上层血清置于新的离心管于-80℃保存；用移液器吸取中间棉状上层免疫细胞至新的50ml离心管。每管加入室温放置的10mL PBS缓冲液，25℃，400 xg离心20分钟。去除上清液，每管加入室温放置的5mL PBS缓冲液，轻轻混匀后，使用血球计数板计算细胞数目，然后25℃，400 xg离心20分钟。去除上清液，根据细胞数目使用RNAiso Plus溶解分离得到的淋巴细胞得到107/mL细胞溶解液，-80℃保存。
2.2构建噬菌体流程：
（1）RNA提取：将用Trizol保存的外周血淋巴细胞冰上溶解后转移至1.5mL的离心管，加入1/5体积的氯仿震荡混匀；室温静置5分钟，4℃ 12000g离心15分钟；将上清液转移到新离心管；离心管中加入与上清液等体积的异丙醇；室温静置10分钟，4℃ 12000g离心10分钟；用75%乙醇清洗沉淀，4℃ 7500g离心5分钟后弃上清，室温晾干沉淀后溶解于适量的无RNA酶的水中。
（2）反转录cDNA：按照反转录试剂盒说明书将上一步得到的RNA一分为二反转录成cDNA，反转录引物分别用Oligo T及random primers。
（3）扩增抗体片段：从反转录的cDNA中扩增特定的抗体片段，使用Taq DNA Polymerase Hot Start酶进行PCR扩增。
（4）将两轮PCR反应得到的PCR扩增产物，利用DNA纯化回收试剂盒回收。
（5）克隆至噬菌体质粒：将上一步扩增得到的多样化抗体基因序列和噬菌体载体进行酶切，各自纯化并进行链接反应。利用DNA纯化回收试剂盒将连接产物回收，并使用超纯水溶解。
（6）转化TG1：将电转杯置于冰上预冷，待TG1感受态细胞100ul融化后加入100ng回收后的连接产物，共同转移到提前预冷的电转杯中，使用电转仪预设的Bacteria转化程序电击转化，电转后立即往电转杯中加入1mL SOC培养基，至少进行20个电转，将细胞37℃复苏60分钟后涂在含有氨苄抗性的LB培养板上过夜生长。将上一步过夜生长后的培养板上的细胞用2xYT培养基和涂布棒冲洗刮下，加入20%的甘油后保存在-80℃。
（7）扩增和纯化噬菌体文库：将上一步刮下的菌体混匀后将数目约为10^9个细菌转移到100mL预先加入氨苄抗生素的2x YT培养液中，37℃ 220rpm培养直至OD600nm达到0.5。辅助噬菌体：细菌细胞的数目，按20:1加入辅助噬菌体，于37℃培养30分钟。再加入卡那霉素，30℃摇床培养一夜。将过夜培养的细菌4℃ 13000rpm离心5分钟，将上清转移到新的离心管后加入1/4体积预冷的 5x PEG8000/NaCl，在冰上孵育30分钟。4℃ 13000rpm离心10分钟，去除上清，加入1mL PBS缓冲液溶解沉淀。再次加入250ul 5X PEG8000/NaCl 后冰上孵育10分钟，4℃ 16000g离心15分钟后去除上清并将沉淀溶解在1mL PBS中得到噬菌体库。
2.3抗体筛选鉴定流程：
（1）包被免疫管：将50ug 抗原加入到2mL PBS中并加入到免疫管中，4℃过夜孵育。
（2）封闭：将适量扩增和纯化的噬菌体加入到1mL 3% BSA中，室温旋转孵育2h。同时往包被好的免疫管中加入2-3mL 3% BSA，室温旋转孵育2h。
（3）抗原和噬菌体孵育：用含有0.01%吐温的PBS将封闭后的免疫管洗3次，每次5分钟。将封闭后的噬菌体文库加入到封闭后的免疫管中，添加PBS至2-3mL，室温旋转孵育1h。
（4）清洗：用含有0.1%吐温的PBS将抗原和噬菌体孵育后的免疫管洗20次，每次5分钟。
（5）洗脱：往免疫管中加入1mL 100mM Trimethymime，室温孵育10分钟，加入1M Tris-HCl中和Trimethymime，将最后1.5mL的洗脱噬菌体转移到新的离心管中。将洗脱的噬菌体按照扩增和纯化噬菌体文库，扩增后再重复筛选过程2次，逐次减半包被免疫管的抗原量，得到3次筛选后的洗脱噬菌体。洗脱的噬菌体可进行NGS测序，得到与抗原结合的候选纳米抗体DNA序列库。
（6）ELISA鉴定：同时，将上一步筛选得到的噬菌体梯度稀释后，各取100ul加入到OD600nm为0.5的TG1菌液中，37℃培养30分钟，后涂布含有氨苄霉素的2x YT培养板上，37℃过夜培养得到单克隆菌落。随机挑选不少于192个单菌落至含有氨苄霉素的2x YT培养液的96孔细胞培养板上，37℃过夜培养后作为种子菌板，重新将菌液2ul 加入新的96孔板（每孔含200ul 2x YT新鲜培养液，100ug/ml 氨苄）5小时后往培养孔中各加入辅助噬菌体，37℃静置30分钟后加入终浓度为50ug/ml的卡纳霉素，30℃过夜培养，后将菌液离心，获得含噬菌体的上清液。
将过夜包被抗原孔及BSA包被对照孔用3% BSA封闭后加入上一步获得的噬菌体上清液，室温孵育1h。用含有0.1%吐温的PBS清洗3次后，加入噬菌体抗体孵育后，用TMB显色后在波长450nm读取每孔的吸光值。选取抗原包被孔与相应对照孔吸光值比例大的菌落送去测序（独立两次phage-Elisa分析），得到纳米抗体的基因序列[2]。
三、关键步骤
3.1免疫技巧：
（1）羊驼的选择和免疫的抗原是免疫成功的关键。选择体态良好的未免羊驼。免疫抗原的纯度以及其正确构象对免疫羊驼后筛选到合适的抗体以致后续应用至关重要，蛋白抗原纯度一般至少不低于90%。
（2）淋巴细胞的分离：及时的细胞分离可以有效阻止血液采集后的溶血以达到最好的分离效果。
（3）免疫周期会影响免疫效果：1-2周免疫间隔，使羊驼对大部分抗原有良好的免疫反应。
3.2构建噬菌体库技巧：
（1）噬菌体文库的库容量和多样性是衡量文库质量的重要标准之一，文库容量大、多样性强是成功筛选出纳米抗体的有效保证；
（2）影响文库容量和多样性的关键点包括：提取RNA过程中RNA的降解、反转录过程中的模板和引物、扩增过程中引物的选择和模板的用量以及PCR扩增轮数、感受态细菌的转化效率、连接体系的大小等因素；
3.3抗体筛选技巧：
（1）合适量的抗原包被和抗原的分子量大小、疏水亲水性质、结构有关，也和包被缓冲液和包被介质的选择有关，合理的包被是成功筛选的基础，如果有必要可以进行预实验确定包被的条件或者可选择抗原结合磁珠的方法进行筛选。
（2）洗脱后测定噬菌体的效价，经过2-4轮抗原包被淘选后，噬菌体的富集程度需要在合理范围之内[3]。
卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)公司建立了完善的、成熟的噬菌体抗体展示技术平台。基于噬菌体展示技术平台，卡梅德生物可以提供包括抗原设计、羊驼免疫、文库构建与筛选、活性功能验证等主要实验环节，可提供高特异性、高亲和力的羊驼VHH抗体。此外，卡梅德生物拥有丰富的抗体工程构造经验，能够进行立体化的抗体上下游服务，包括抗体人源化服务、人源scFV抗体库构建服务、人源Fab抗体文库构建服务、人源抗体噬菌体文库制备服务以及磷酸化抗体定制服务、抗体亲和力成熟服务等，满足不同客户的科研要求。
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参考文献：
- Muyldermans S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annu Rev Biochem. 2013;82:775-97.
- De Genst E, Saerens D, Muyldermans S, Conrath K. Antibody repertoire development in camelids. Dev Comp Immunol. 2006;30(1-2):187-98.
- Rossotti MA, Trempe F, van Faassen H, Hussack G, Arbabi-Ghahroudi M. Isolation and Characterization of Single-Domain Antibodies from Immune Phage Display Libraries. Methods Mol Biol. 2023;2702:107-147.