冷冻电镜背景了解

什么是冷冻电镜？

冷冻电子显微技术（冷冻电镜）始于玻璃化，在此过程中，蛋白质溶液迅速冷却，以至于水分子来不及结晶，从而形成对样品结构几乎没有破坏的非结晶固体（这一过程称为玻璃化）。随后，将根据颗粒浓度、分布和取向来筛选样品。接下来，将获取一系列图像，并通过计算提取二维类。最后，数据经过重构软件的处理，生成准确、详细的亚细胞和分子级复杂生物结构 3D 模型。这些模型可以显示之前无法可视化的相互作用，这是很多科学成果的关键所在。

冷冻电镜的历史

冷冻电镜历史悠久，凝聚了很多研究团体的努力，他们为冷冻电镜的演变和变革做出了同等重要的贡献。经过 40 多年的潜心研究，结构生物学界取得了大量的技术进步成果（探测器、自动化、软件等），最终使现代冷冻电镜变成了可能。2017 年诺贝尔化学奖颁给了三位用数十年时间致力于推动冷冻电镜发展的研究人员：

1975 年，Joachim Frank 开始研究可以分析模糊 2D 图像并将其重构为锐利 3D 结构的算法。 

1980 年代早期，Jacques Dubochet 成功将水玻璃化，从而使生物分子能够在真空中保持它们的形状。

1990 年，Richard Henderson 率先使用电子显微镜生成原子级分辨率的蛋白质三维图像。

大佬的图片在这里，都是偶像级别的人物：

三位大佬

用我自己的一句话来概括：把诺贝尔化学奖颁给了运用物理学方法探测生物结构的三位大佬

冷冻电镜的崛起

冷冻电镜相对于常规结构生物学技术的最大优势之一在于，它能够分析大型、复杂和柔性的结构。通常，这些结构无法结晶以用于 X 射线晶体学 (XRD) 分析，或体积过大且十分复杂，导致难以进行核磁共振 (NMR) 光谱分析。这些结构包括很多在生物学上很重要的蛋白质，特别是具有膜蛋白质等可变或柔性结构的蛋白质。现在，一些成熟的结构测定方法（XRD 和 NMR）经常与冷冻电镜密度图相集成，以便得到复杂、动态分子组装的原子级分辨率模型。

自从 1997 年第一个基于冷冻电镜重构的模型存入 PDB（蛋白质数据库）以来，存入的结构数量呈现出指数级增长。冷冻电镜是 2016 年 EMDB 条目突破 1,000 的原因所在，所有条目数量的四分之一就是在这一年存入的。在这些最近存入的数据中，很多包括了之前被认为无法进行结构测定的关键大分子组装。

科学成果

在冷冻电镜的帮助下，研究人员定义了世界上第一个共济失调毛细血管扩张突变 (ATM) 基因的蛋白质结构。ATM 是 DNA 损伤反应中的一个关键触发蛋白质，也是癌症研究中的主要治疗目标。这一研究可以在抗癌新药的开发中证明自身无可估量的价值。《Science Advances》，2017 年 5 月 10 日。

研究人员已经使用冷冻电镜测定了 B 类 G 蛋白偶联受体 (GPCR) 的三元复合体结构，这是一种难以通过其他方法分析的重要膜蛋白质复合体。《自然》，2017 年 6 月 1 日。

利用 Thermo Scientific™ Krios 冷冻 TEM 和 SPA 工作流，研究人员得以更清晰地解析多种病毒的结构，包括 HIV、寨卡、埃博拉和 C 型鼻病毒。《PNA》，2016 年 8 月 9 日。

单颗粒cryo-EM实验方法

流程图大致如下：

单颗粒工作流程