EasyAmplicon (易扩增子)-扩增子高通量序列分析软件流程及脚本-详细使用方法——来自刘永鑫团队的秘籍

其他不重要，重要的是方向，资源，还要好用，建议大家先看看论文介绍：

https://doi.org/10.1002/imt2.83EasyAmplicon: An easy‐to‐use, open‐source, reproducible, and community‐based pipeline for amplicon data analysis in microbiome research - Liu - 2023 - iMeta - Wiley Online Libraryhttps://doi.org/10.1002/imt2.83

 然后再看看代码仓库：

YongxinLiu/EasyAmplicon: Easy Amplicon data analysis pipeline (github.com)

 

1、下载EasyAmplicon 

 windows或linux一般都会装git吧，直接clone

git clone https://github.com/YongxinLiu/EasyAmplicon.git

或者一般下载链接

https://github.com/YongxinLiu/EasyAmplicon/archive/refs/heads/master.zip

百度网盘（这个真贴心，国内不担心上不了github了：

百度网盘 请输入提取码

这里还有相关的近500个R包直接下载，省去安装和调试R了，不过不同环境下可能出现小错误，需要有一定的调试技能：百度网盘 请输入提取码

2、开始使用

这里这个主要是扩增子的流程，这里刘大神收集了大家分析常用的软件，缺少软件的先看看这个仓库吧，GitHub - YongxinLiu/EasyMicrobiome

这里有EasyMicrobiome的介绍 ：EasyMicrobiome-易扩增子、易宏基因组等分析流程依赖常用软件、脚本文件和数据库注释文件-CSDN博客

习惯用linux了，所以按照linux方法做， 先打开EasyAmplicon下的pipeline.sh文件，建议使用notepad或者sublime txt

运行前可以先将EasyAmplicon文件加入系统环境，这样使用脚本的时候不需要带EasyAmplicon文件夹的绝对路径了。按个人喜好来定吧。

先进入全新目录：

#进入工作目录，工作目录名字可以自己修改
cd /work

# 1. 分析流程pipeline.sh
# 2. 样本元信息metadata.txt，保存于result目录
# 3. 测序数据fastq文件保存于seq目录，通常以`.fq.gz`结尾，每个样品一对文件
# 4. 创建临时文件存储目录，分析结束可删除
mkdir -p seq result temp 

 先按照大神自己的实验设计描述整理一个全信息的表格，表头设置为一样，这里就不解释字段意思了，会实验设计的基本都了解，样例文件在EasyAmplicon/result下，大家同样整理一个名为metadata_raw.txt的文件放入新的work文件夹

在work文件夹下，将metadata_raw.txt进一步去除结尾符号，主要是windows系统和linux系统差异，并命名为metadata.txt

    # windows用户结尾有^M，运行sed命令去除，再用cat -A检查
    sed 's/\r//' result/metadata_raw.txt > result/metadata.txt
    cat -A result/metadata.txt | head -n3

如果直接在linux下建立的文件大家不需要这个步骤了，直接按实验设计整理一个metadata.txt文件即可，如果是windows下写的设计文件建议在ftp上传的时候选择使用二进制方式上传就不用这个步骤处理了。

进入seq文件夹

cd seq

下载样品序列，放入seq目录下

已有样品数据在EasyAmplicon/seq下，这里是每个样品一对序列文件，如果样品是混合样可以先拆样后按相同的方式将序列文件命名后放入下面目录：

统计测序数据，依赖seqtk程序，没有的自己搜索找一个吧：

#seqkit统计测序数据
seqkit stat seq/*.fq.gz > result/seqkit.txt

#查看统计信息
head result/seqkit.txt

单个文件的查询方法在pipeline里面已有说明，大家按照里面的命令执行即可查看，不再细说 

序列合并并按样品重命名，仍然为单个样品

#测试.以WT1单样品合并为例
#time统计计算时间，real是物理时间，user是计算时间，sys是硬件等待时间
time vsearch --fastq_mergepairs seq/WT1_1.fq.gz \
   --reverse seq/WT1_2.fq.gz \
   --fastqout temp/WT1.merged.fq \
   --relabel WT1.

#
head temp/WT1.merged.fq

可以使用for循环或者rush进行批量处理

#方法1.for循环顺序处理
time for i in `tail -n+2 result/metadata.txt|cut -f1`;do
   vsearch --fastq_mergepairs seq/${i}_1.fq.gz --reverse seq/${i}_2.fq.gz \
   --fastqout temp/${i}.merged.fq --relabel ${i}.
 done &

# 一部分电脑 rush 不支持，运行时调度失败，请使用 for 循环部分
#方法2.rush并行处理，任务数jobs(j),2可加速1倍4s；建议设置2-4
time tail -n+2 result/metadata.txt | cut -f 1 | \
    rush -j 2 "vsearch --fastq_mergepairs seq/{}_1.fq.gz --reverse seq/{}_2.fq.gz \
    --fastqout temp/{}.merged.fq --relabel {}."

序列合并处理完成后，所有的序列名称都加上了label，所以为提高效率，后面将合并所有样品的序列在一起

合并所有样品序列

从这里开始就与混合样品测序的样品在merge后进行relabel之后的状态一致了。

#合并所有样品至同一文件
cat temp/*.merged.fq > temp/all.fq

#查看文件大小223M，软件不同版本结果略有差异
ls -lsh temp/all.fq

# 查看序列名，“.”之前是否为样本名，样本名绝不允许有点 (".")
# 样本名有点 (.) 的一个显著特征是生成的特征表会很大，特征表里面列很多，导致后面分析出现内存不足。
# 后面分析获得特征表后要看一眼有没有问题，遇到内存不足问题，也要回头来排查。
head -n 6 temp/all.fq|cut -c1-60

切除引物和质控

# 左端10bp标签+19bp上游引物V5共为29，右端V7为18bp下游引物
# Cut barcode 10bp + V5 19bp in left and V7 18bp in right
# 务必清楚实验设计和引物长度，引物已经去除可填0，27万条序列14s
time vsearch --fastx_filter temp/all.fq \
  --fastq_stripleft 29 --fastq_stripright 18 \
  --fastq_maxee_rate 0.01 \
  --fastaout temp/filtered.fa

# 查看文件了解fa文件格式
head temp/filtered.fa

序列去冗余 Dereplicate

# 并添加miniuniqusize最小为8或1/1M，去除低丰度噪音并增加计算速度
# -sizeout输出丰度, --relabel必须加序列前缀更规范, 1s
vsearch --derep_fulllength temp/filtered.fa \
  --minuniquesize 10 --sizeout --relabel Uni_ \
  --output temp/uniques.fa

#高丰度非冗余序列非常小(500K~5M较适合)，名称后有size和频率

聚类OTU/去噪ASV Cluster or denoise

#有两种方法：推荐unoise3去噪获得单碱基精度ASV，备选传统的97%聚类OTU(属水平精度)
#usearch两种特征挑选方法均自带de novo去嵌合体
#-minsize二次过滤，控制OTU/ASV数量至1-5千，方便下游统计分析

#方法1. 97%聚类OTU，适合大数据/ASV规律不明显/reviewer要求
#结果耗时1s, 产生508 OTUs, 去除126 chimeras
usearch -cluster_otus temp/uniques.fa -minsize 10 \
  -otus temp/otus.fa \
  -relabel OTU_

#方法2. ASV去噪 Denoise: predict biological sequences and filter chimeras
#6s, 1530 good, 41 chimeras, 序列百万条可能需要几天/几周
usearch -unoise3 temp/uniques.fa -minsize 10 \
  -zotus temp/zotus.fa

#修改序列名：Zotu为改为ASV方便识别
sed 's/Zotu/ASV_/g' temp/zotus.fa > temp/otus.fa

查看otus.fa，序列名称都更改了。

基于参考去嵌合 Reference-based chimera detect

这里如果去除嵌合体的话就需要有rdp的数据库了，需提前下载好

# 不推荐，容易引起假阴性，因为参考数据库无丰度信息
# 而de novo时要求亲本丰度为嵌合体16倍以上防止假阴性
# 因为已知序列不会被去除，数据库选择越大越合理，假阴性率最低
mkdir -p result/raw

# 方法1. vsearch+rdp去嵌合(快但容易假阴性)
# 可自行下载silva并解压(替换rdp_16s_v18.fa为silva_16s_v123.fa)，极慢但理论上更好
vsearch --uchime_ref temp/otus.fa \
  -db ${db}/usearch/rdp_16s_v18.fa \
  --nonchimeras result/raw/otus.fa
# RDP: 7s, 143 (9.3%) chimeras; SILVA：9m, 151 (8.4%) chimeras
# Win vsearch结果添加了windows换行符^M需删除，mac不要执行此命令，linux下应该也不需要
sed -i 's/\r//g' result/raw/otus.fa

# 方法2. 不去嵌合，直接cp到指定工作目录
# cp -f temp/otus.fa result/raw/otus.fa

特征表构建和筛选 Feature table create and filter

# OTU和ASV统称为特征(Feature)，它们的区别是：
# OTU通常按97%聚类后挑选最高丰度或中心的代表性序列；
# ASV是基于序列进行去噪(排除或校正错误序列，并挑选丰度较高的可信序列)作为代表性序列

生成特征表

# id(1)：100%相似度比对49.45%序列，1m50s
# id(0.97)：97%相似度比对83.66%序列，1m10s(更高数据使用率，更快)
time vsearch --usearch_global temp/filtered.fa \
  --db result/raw/otus.fa \
  --id 0.97 --threads 4 \
    --otutabout result/raw/otutab.txt 

#212862 of 268019 (79.42%)可比对
# vsearch结果windows用户删除换行符^M校正为标准Linux格式
sed -i 's/\r//' result/raw/otutab.txt
head -n6 result/raw/otutab.txt | cut -f 1-6 |cat -A

# csvtk统计表行列
# 这里一定看好列数，是不是等于你的样品数；如果不等，一般是样品命名存在问题，具体看上面解释
csvtk -t stat result/raw/otutab.txt

物种注释，且/或去除质体和非细菌 Remove plastid and non-Bacteria

 先统计otu表的特征数，包括每个样品的otu总数

其他pipeline的筛选可根据需求和喜好来吧，不确定或感觉没必要的掠过即可，直接统计otu表信息

# 物种注释-去除质体和非细菌/古菌并统计比例(可选)
# RDP物种注释(rdp_16s_v18)更快，但缺少完整真核来源数据,可能不完整，耗时15s;
# SILVA数据库(silva_16s_v123.fa)更好注释真核、质体序列，极慢耗时3h起
# 置信阈值通常0.6/0.8，vserch最低0.1/usearch可选0输出最相似物种注释用于观察潜在分类
vsearch --sintax result/raw/otus.fa \
  --db ${db}/usearch/rdp_16s_v18.fa \
  --sintax_cutoff 0.1 \
  --tabbedout result/raw/otus.sintax 

sed -i 's/\r//' result/raw/otus.sintax
########################
#物种注释结果：
ASV_7	d:Bacteria(1.00),p:Bacteroidetes(1.00),c:Flavobacteriia(1.00),o:Flavobacteriales(1.00),f:Flavobacteriaceae(1.00),g:Flavobacterium(1.00)	+ d:Bacteria,p:Bacteroidetes,c:Flavobacteriia,o:Flavobacteriales,f:Flavobacteriaceae,g:Flavobacterium
ASV_5	d:Bacteria(1.00),p:Cyanobacteria/Chloroplast(1.00),c:Chloroplast(1.00),f:Chloroplast(1.00),g:Streptophyta(1.00)	+	d:Bacteria,p:Cyanobacteria/Chloroplast,c:Chloroplast,f:Chloroplast,g:Streptophyta
ASV_4	d:Bacteria(1.00),p:Proteobacteria(1.00),c:Betaproteobacteria(1.00),o:Burkholderiales(1.00),f:Comamonadaceae(1.00),g:Rhizobacter(0.98)	+ d:Bacteria,p:Proteobacteria,c:Betaproteobacteria,o:Burkholderiales,f:Comamonadaceae,g:Rhizobacter
ASV_3	d:Bacteria(1.00),p:Proteobacteria(1.00),c:Betaproteobacteria(1.00),o:Burkholderiales(1.00),f:Comamonadaceae(1.00),g:Rhizobacter(0.93)	+ d:Bacteria,p:Proteobacteria,c:Betaproteobacteria,o:Burkholderiales,f:Comamonadaceae,g:Rhizobacter
ASV_2	d:Bacteria(1.00),p:Proteobacteria(1.00),c:Betaproteobacteria(1.00),o:Burkholderiales(1.00),f:Comamonadaceae(1.00),g:Pelomonas(1.00)	+ d:Bacteria,p:Proteobacteria,c:Betaproteobacteria,o:Burkholderiales,f:Comamonadaceae,g:Pelomonas


#OTU表简单统计 Summary OTUs table
usearch -otutab_stats result/otutab.txt \
  -output result/otutab.stat

cat result/otutab.stat

    207572  Reads (207.6k)
        18  Samples
      1363  OTUs

     24534  Counts
      4507  Count  =0  (18.4%)
      4229  Count  =1  (17.2%)
      3999  Count >=10 (16.3%)

       413  OTUs found in all samples (30.3%)
       576  OTUs found in 90% of samples (42.3%)
      1276  OTUs found in 50% of samples (93.6%)

Sample sizes: min 10425, lo 10953, med 11549, mean 11531.8, hi 11924, max 13209

 等量抽样标准化 Normlize by subsample

这里主要是依赖R包了，使用R运行，可以脚本运行，或者直接将otutab_rare.R文件打开在R终端或studio的交互窗口直接运行

#使用vegan包进行等量重抽样，输入reads count格式Feature表result/otutab.txt
#可指定输入文件、抽样量和随机数，输出抽平表result/otutab_rare.txt和多样性alpha/vegan.txt
mkdir -p result/alpha
Rscript ${db}/script/otutab_rare.R --input result/otutab.txt \
  --depth 10000 --seed 1 \
  --normalize result/otutab_rare.txt \
  --output result/alpha/vegan.txt

#再统计查看抽样后的信息
usearch -otutab_stats result/otutab_rare.txt \
  -output result/otutab_rare.stat
cat result/otutab_rare.stat

计算α多样性 calculate alpha diversity

# 使用USEARCH计算14种alpha多样性指数(Chao1有错勿用)
#details in http://www.drive5.com/usearch/manual/alpha_metrics.html
usearch -alpha_div result/otutab_rare.txt \
  -output result/alpha/alpha.txt

#当然大家可使用自己的R程序来进行alpha多样性的计算

计算稀释丰富度 calculate rarefaction richness

#稀释曲线：取1%-100%的序列中OTUs数量，每次无放回抽样
#Rarefaction from 1%, 2% .. 100% in richness (observed OTUs)-method without_replacement https://drive5.com/usearch/manual/cmd_otutab_subsample.html
usearch -alpha_div_rare result/otutab_rare.txt \
  -output result/alpha/alpha_rare.txt \
  -method without_replacement

#预览结果
head -n2 result/alpha/alpha_rare.txt

#样本测序量低出现非数值"-"的处理，详见常见问题8
sed -i "s/-/\t0.0/g" result/alpha/alpha_rare.txt

筛选高丰度菌 Filter by abundance

#计算各特征的均值，有组再求分组均值，需根据实验设计metadata.txt修改组列名
#输入文件为feautre表result/otutab.txt，实验设计metadata.txt
#输出为特征表按组的均值-一个实验可能有多种分组方式
#-h显示脚本帮助(参数说明)
Rscript ${db}/script/otu_mean.R -h

#scale是否标准化，zoom标准化总和，all输出全部样本均值，type计算类型mean或sum
Rscript ${db}/script/otu_mean.R --input result/otutab.txt \
  --metadata result/metadata.txt \
  --group Group --thre 0 \
  --scale TRUE --zoom 100 --all TRUE --type mean \
  --output result/otutab_mean.txt

# 结果为全部和各组均值
head -n3 result/otutab_mean.txt

#如以平均丰度>0.1%筛选，可选0.5或0.05，得到每个组的OTU组合
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}{if(FNR==1) {for(i=3;i<=NF;i++) a[i]=$i; print "OTU","Group";} \
    else {for(i=3;i<=NF;i++) if($i>0.1) print $1, a[i];}}' \
    result/otutab_mean.txt > result/alpha/otu_group_exist.txt

head result/alpha/otu_group_exist.txt

cut -f 2 result/alpha/otu_group_exist.txt | sort | uniq -c
# 试一试：不同丰度下各组有多少OTU/ASV
# 可在 http://ehbio.com/test/venn/ 中绘图并显示各组共有和特有维恩或网络图
# 也可在 http://www.ehbio.com/ImageGP 绘制Venn、upSetView和Sanky

β多样性 Beta diversity

#结果有多个文件，需要目录
mkdir -p result/beta/

#基于OTU构建进化树 Make OTU tree, 4s
usearch -cluster_agg result/otus.fa -treeout result/otus.tree

#生成5种距离矩阵：bray_curtis, euclidean, jaccard, manhatten, unifrac
usearch -beta_div result/otutab_rare.txt -tree result/otus.tree \
  -filename_prefix result/beta/

物种注释分类汇总

#OTU对应物种注释2列格式：去除sintax中置信值，只保留物种注释，替换:为_，删除引号
cut -f 1,4 result/otus.sintax \
  |sed 's/\td/\tk/;s/:/__/g;s/,/;/g;s/"//g' \
  > result/taxonomy2.txt
head -n3 result/taxonomy2.txt

#OTU对应物种8列格式：注意注释是非整齐
#生成物种表格OTU/ASV中空白补齐为Unassigned
awk 'BEGIN{OFS=FS="\t"}{delete a; a["k"]="Unassigned";a["p"]="Unassigned";a["c"]="Unassigned";a["o"]="Unassigned";a["f"]="Unassigned";a["g"]="Unassigned";a["s"]="Unassigned";\
  split($2,x,";");for(i in x){split(x[i],b,"__");a[b[1]]=b[2];} \
  print $1,a["k"],a["p"],a["c"],a["o"],a["f"],a["g"],a["s"];}' \
  result/taxonomy2.txt > temp/otus.tax
sed 's/;/\t/g;s/.__//g;' temp/otus.tax|cut -f 1-8 | \
  sed '1 s/^/OTUID\tKingdom\tPhylum\tClass\tOrder\tFamily\tGenus\tSpecies\n/' \
  > result/taxonomy.txt
head -n3 result/taxonomy.txt

#统计门纲目科属，使用 rank参数 p c o f g，为phylum, class, order, family, genus缩写
mkdir -p result/tax
for i in p c o f g;do
  usearch -sintax_summary result/otus.sintax \
  -otutabin result/otutab_rare.txt -rank ${i} \
  -output result/tax/sum_${i}.txt
done
sed -i 's/(//g;s/)//g;s/\"//g;s/\#//g;s/\/Chloroplast//g' result/tax/sum_*.txt

# 列出所有文件
wc -l result/tax/sum_*.txt
head -n3 result/tax/sum_g.txt

有参定量特征表

# 比对Greengenes97% OTUs比对，用于PICRUSt/Bugbase功能预测
mkdir -p result/gg/

# usearch比对更快，但文件超限报错选附录14 vsearch比对
# 默认10核以下使用1核，10核以上使用10核
usearch -otutab temp/filtered.fa -otus ${db}/gg/97_otus.fa \
    -otutabout result/gg/otutab.txt -threads 4
# 比对率80.0%, 1核11m，4核3m，10核2m，内存使用743Mb
head -n3 result/gg/otutab.txt

#统计
usearch -otutab_stats result/gg/otutab.txt -output result/gg/otutab.stat
cat result/gg/otutab.stat

空间清理及数据提交 

这个步骤应该放在最后文章撰写完成后再处理，因为有些中间文件可能需要调整参数重新处理，有些大文件不用再重复cp了，另外，提交数据也是在文章接收后才会用到。

#删除中间大文件
rm -rf temp/*.fq

# 分双端统计md5值，用于数据提交
cd seq
md5sum *_1.fq.gz > md5sum1.txt
md5sum *_2.fq.gz > md5sum2.txt
paste md5sum1.txt md5sum2.txt | awk '{print $2"\t"$1"\t"$4"\t"$3}' | sed 's/*//g' > ../result/md5sum.txt
rm md5sum*
cd ..
cat result/md5sum.txt

统计分析及出图

Alpha多样性

#Alpha多样性箱线图，对于不同样品数的作图，建议单个运行后再逐个调整参数以使出图布局最佳

# 查看帮助
Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R -h
# 完整参数，多样性指数可选richness chao1 ACE shannon simpson invsimpson
Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R --alpha_index richness \
  --input result/alpha/vegan.txt --design result/metadata.txt \
  --group Group --output result/alpha/ \
  --width 89 --height 59

# 使用循环绘制6种常用指数
for i in `head -n1 result/alpha/vegan.txt|cut -f 2-`;do
  Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R --alpha_index ${i} \
    --input result/alpha/vegan.txt --design result/metadata.txt \
    --group Group --output result/alpha/ \
    --width 89 --height 59
done
mv alpha_boxplot_TukeyHSD.txt result/alpha/

# Alpha多样性柱状图+标准差
Rscript ${db}/script/alpha_barplot.R --alpha_index richness \
  --input result/alpha/vegan.txt --design result/metadata.txt \
  --group Group --output result/alpha/ \
  --width 89 --height 59


### 1.2 稀释曲线

Rscript ${db}/script/alpha_rare_curve.R \
  --input result/alpha/alpha_rare.txt --design result/metadata.txt \
  --group Group --output result/alpha/ \
  --width 120 --height 59

### 1.3 多样性维恩图

# 三组比较:-f输入文件,-a/b/c/d/g分组名,-w/u为宽高英寸,-p输出文件名后缀
bash ${db}/script/sp_vennDiagram.sh \
  -f result/alpha/otu_group_exist.txt \
  -a WT -b KO -c OE \
  -w 3 -u 3 \
  -p WT_KO_OE
# 四组比较，图和代码见输入文件目录，运行目录为当前项目根目录

bash ${db}/script/sp_vennDiagram.sh \
  -f result/alpha/otu_group_exist.txt \
  -a WT -b KO -c OE -d All \
  -w 3 -u 3 \
  -p WT_KO_OE_All
# EVenn在线绘制维恩图 https://www.ehbio.com/test/venn

 

Beta多样性

### 2.1 距离矩阵热图pheatmap

# 添加分组注释，如2，4列的基因型和地点
cut -f 1-2 result/metadata.txt > temp/group.txt
# 以bray_curtis为例，-f输入文件,-h是否聚类TRUE/FALSE,-u/v为宽高英寸
# -P添加行注释文件，-Q添加列注释
bash ${db}/script/sp_pheatmap.sh \
  -f result/beta/bray_curtis.txt \
  -H 'TRUE' -u 6.9 -v 5.6 \
  -P temp/group.txt -Q temp/group.txt

主坐标分析PCoA

# 输入文件，选择分组，输出文件，图片尺寸mm，统计见beta_pcoa_stat.txt
Rscript ${db}/script/beta_pcoa.R \
  --input result/beta/bray_curtis.txt --design result/metadata.txt \
  --group Group --label FALSE --width 89 --height 59 \
  --output result/beta/bray_curtis.pcoa.pdf
# 添加样本标签 --label TRUE
Rscript ${db}/script/beta_pcoa.R \
  --input result/beta/bray_curtis.txt --design result/metadata.txt \
  --group Group --label TRUE --width 89 --height 59 \
  --output result/beta/bray_curtis.pcoa.label.pdf
mv beta_pcoa_stat.txt result/beta/

 限制性主坐标分析CPCoA

Rscript ${db}/script/beta_cpcoa.R \
  --input result/beta/bray_curtis.txt --design result/metadata.txt \
  --group Group --output result/beta/bray_curtis.cpcoa.pdf \
  --width 89 --height 59

# 添加样本标签 --label TRUE
Rscript ${db}/script/beta_cpcoa.R \
  --input result/beta/bray_curtis.txt --design result/metadata.txt \
  --group Group --label TRUE --width 89 --height 59 \
  --output result/beta/bray_curtis.cpcoa.label.pdf

 物种组成Taxonomy

### 3.1 堆叠柱状图Stackplot

# 以门(p)水平为例，结果包括output.sample/group.pdf两个文件
Rscript ${db}/script/tax_stackplot.R \
  --input result/tax/sum_p.txt --design result/metadata.txt \
  --group Group --color ggplot --legend 7 --width 89 --height 59 \
  --output result/tax/sum_p.stackplot

# 修改颜色--color ggplot, manual1(22), Paired(12) or Set3(12)
Rscript ${db}/script/tax_stackplot.R \
  --input result/tax/sum_p.txt --design result/metadata.txt \
  --group Group --color Paired --legend 12 --width 181 --height 119 \
  --output result/tax/sum_p.stackplotPaired
  
# 批量绘制输入包括p/c/o/f/g共5级
for i in p c o f g; do
Rscript ${db}/script/tax_stackplot.R \
  --input result/tax/sum_${i}.txt --design result/metadata.txt \
  --group Group --output result/tax/sum_${i}.stackplot \
  --legend 8 --width 89 --height 59; done

### 3.2 弦/圈图circlize

# 以纲(class,c)为例，绘制前5组
i=c
Rscript ${db}/script/tax_circlize.R \
  --input result/tax/sum_${i}.txt --design result/metadata.txt \
  --group Group --legend 5

# 结果位于当前目录circlize.pdf(随机颜色)，circlize_legend.pdf(指定颜色+图例)
# 移动并改名与分类级一致
mv circlize.pdf result/tax/sum_${i}.circlize.pdf
mv circlize_legend.pdf result/tax/sum_${i}.circlize_legend.pdf

### 3.3 树图treemap(参考)

# 多层级包含物种关系，输入特征表和物种注释，输出树图
# 指定包含特征数量和图片宽高，100个ASV耗时12s
Rscript ${db}/script/tax_maptree.R \
  --input result/otutab.txt --taxonomy result/taxonomy.txt \
  --output result/tax/tax_maptree.pdf \
  --topN 100 --width 183 --height 118

差异比较

## 1. R语言差异分析

### 1.1 差异比较

# Error in file(file, ifelse(append, "a", "w")),输出目录不存在，创建目录即可
mkdir -p result/compare/
# 输入特征表、元数据；指定分组列名、比较组和丰度
# 选择方法 wilcox/t.test/edgeR、pvalue和fdr和输出目录
compare="KO-WT"
Rscript ${db}/script/compare.R \
  --input result/otutab.txt --design result/metadata.txt \
  --group Group --compare ${compare} --threshold 0.1 \
  --method edgeR --pvalue 0.05 --fdr 0.2 \
  --output result/compare/

### 1.2 火山图

# 输入compare.R的结果，输出火山图带数据标签，可指定图片大小
Rscript ${db}/script/compare_volcano.R \
  --input result/compare/${compare}.txt \
  --output result/compare/${compare}.volcano.pdf \
  --width 89 --height 59

### 1.3 热图

# 输入compare.R的结果，筛选列数，指定元数据和分组、物种注释，图大小英寸和字号
bash ${db}/script/compare_heatmap.sh -i result/compare/${compare}.txt -l 7 \
   -d result/metadata.txt -A Group \
   -t result/taxonomy.txt \
   -w 8 -h 5 -s 7 \
   -o result/compare/${compare}

### 1.4 曼哈顿图

# i差异比较结果,t物种注释,p图例,w宽,v高,s字号,l图例最大值
# 图例显示不图，可增加高度v为119+即可，后期用AI拼图为KO-WT.heatmap.emf
bash ${db}/script/compare_manhattan.sh -i result/compare/${compare}.txt \
   -t result/taxonomy.txt \
   -p result/tax/sum_p.txt \
   -w 183 -v 59 -s 7 -l 10 \
   -o result/compare/${compare}.manhattan.p.pdf
# 上图只有6个门，切换为纲c和-L Class展示细节
bash ${db}/script/compare_manhattan.sh -i result/compare/${compare}.txt \
   -t result/taxonomy.txt \
   -p result/tax/sum_c.txt \
   -w 183 -v 59 -s 7 -l 10 -L Class \
   -o result/compare/${compare}.manhattan.c.pdf
# 显示完整图例，再用AI拼图
bash ${db}/script/compare_manhattan.sh -i result/compare/${compare}.txt \
   -t result/taxonomy.txt \
   -p result/tax/sum_c.txt \
   -w 183 -v 149 -s 7 -l 10 -L Class \
   -o result/compare/${compare}.manhattan.c.legend.pdf

### 1.5 单个特征的绘制

# 筛选显示差异ASV，按KO组丰度降序列，取ID展示前10
awk '$4<0.05' result/compare/KO-WT.txt | sort -k7,7nr | cut -f1 | head
# 差异OTU细节展示
Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R --alpha_index ASV_2 \
  --input result/otutab.txt --design result/metadata.txt \
  --transpose TRUE --scale TRUE \
  --width 89 --height 59 \
  --group Group --output result/compare/feature_ 
# ID不存在会报错： Error in data.frame(..., check.names = FALSE) : 参数值意味着不同的行数: 0, 18  Calls: alpha_boxplot -> cbind -> cbind -> data.frame

# 指定某列排序：按属丰度均值All降序
csvtk -t sort -k All:nr result/tax/sum_g.txt | head
# 差属细节展示
Rscript ${db}/script/alpha_boxplot.R --alpha_index Lysobacter \
  --input result/tax/sum_g.txt --design result/metadata.txt \
  --transpose TRUE \
  --width 89 --height 59 \
  --group Group --output result/compare/feature_

### 1.5 三元图

#参考示例见：result\compare\ternary\ternary.Rmd 文档
#备选教程[246.三元图的应用与绘图实战](https://mp.weixin.qq.com/s/3w3ncpwjQaMRtmIOtr2Jvw)

STAMP输入文件准备

### 2.1 生成输入文件

Rscript ${db}/script/format2stamp.R -h
mkdir -p result/stamp
Rscript ${db}/script/format2stamp.R --input result/otutab.txt \
  --taxonomy result/taxonomy.txt --threshold 0.01 \
  --output result/stamp/tax
# 可选Rmd文档见result/format2stamp.Rmd

### 2.2 绘制扩展柱状图和表

compare="KO-WT"
# 替换ASV(result/otutab.txt)为属(result/tax/sum_g.txt)
Rscript ${db}/script/compare_stamp.R \
  --input result/stamp/tax_5Family.txt --metadata result/metadata.txt \
  --group Group --compare ${compare} --threshold 0.1 \
  --method "t.test" --pvalue 0.05 --fdr "none" \
  --width 189 --height 159 \
  --output result/stamp/${compare}
# 可选Rmd文档见result/CompareStamp.Rmd

LEfSe输入文件准备

### 3.1. 命令行生成文件
# 可选命令行生成输入文件
Rscript ${db}/script/format2lefse.R -h
mkdir -p result/lefse
# threshold控制丰度筛选以控制作图中的枝数量
Rscript ${db}/script/format2lefse.R --input result/otutab.txt \
  --taxonomy result/taxonomy.txt --design result/metadata.txt \
  --group Group --threshold 0.4 \
  --output result/lefse/LEfSe

### 3.2 Rmd生成输入文件(可选)
#1. result目录中存在otutab.txt, metadata.txt, taxonomy.txt三个文件；
#2. Rstudio打开EasyAmplicon中format2lefse.Rmd，另存至result目录并Knit生成输入文件和可重复计算网页；

### 3.3 LEfSe分析
#方法1. 打开LEfSe.txt并在线提交 https://www.bic.ac.cn/BIC/#/analysis?page=b%27MzY%3D%27
#方法2. LEfSe本地分析(限Linux系统、选学)，参考代码见附录
#方法3. LEfSe官网在线使用

QIIME 2分析流程

代码详见 qiime2/pipeline_qiime2.sh

功能预测

## 1. PICRUSt功能预测

### PICRUSt 1.0

# 方法1. 使用 http://www.ehbio.com/ImageGP 在线分析 gg/otutab.txt
# 方法2. Linux服务器用户可参考"附录2. PICRUSt功能预测"实现软件安装和分析
# 然后结果使用STAMP/R进行差异比较
# R语言绘图
# 输入文件格式调整
l=L2
sed '/# Const/d;s/OTU //' result/picrust/all_level.ko.${l}.txt > result/picrust/${l}.txt
num=`head -n1 result/picrust/${l}.txt|wc -w`
paste <(cut -f $num result/picrust/${l}.txt) <(cut -f 1-$[num-1] result/picrust/${l}.txt) \
  > result/picrust/${l}.spf
cut -f 2- result/picrust/${l}.spf > result/picrust/${l}.mat.txt
awk 'BEGIN{FS=OFS="\t"} {print $2,$1}' result/picrust/${l}.spf | sed 's/;/\t/' | sed '1 s/ID/Pathway\tCategory/' \
  > result/picrust/${l}.anno.txt
# 差异比较
compare="KO-WT"
Rscript ${db}/script/compare.R \
  --input result/picrust/${l}.mat.txt --design result/metadata.txt \
  --group Group --compare ${compare} --threshold 0 \
  --method wilcox --pvalue 0.05 --fdr 0.2 \
  --output result/picrust/
# 可对结果${compare}.txt筛选
# 绘制指定组(A/B)的柱状图，按高分类级着色和分面
Rscript ${db}/script/compare_hierarchy_facet.R \
  --input result/picrust/${compare}.txt \
  --data MeanA \
  --annotation result/picrust/${l}.anno.txt \
  --output result/picrust/${compare}.MeanA.bar.pdf
# 绘制两组显著差异柱状图，按高分类级分面
Rscript ${db}/script/compare_hierarchy_facet2.R \
  --input result/picrust/${compare}.txt \
  --pvalue 0.05 --fdr 0.1 \
  --annotation result/picrust/${l}.anno.txt \
  --output result/picrust/${compare}.bar.pdf

 ### PICRUSt 2.0

# 软件安装见附录6. PICRUSt环境导出和导入

# (可选)PICRUSt2(Linux/Windows下Linux子系统，要求>16GB内存)
# 安装参考附录5的方式直接下载安装包并解压即可使用

# Linux中加载conda环境
conda activate picrust2
# 进入工作目录，服务器要修改工作目录
wd=/mnt/d/amplicon/result/picrust2
mkdir -p ${wd} && cd ${wd}
# 运行流程，内存15.7GB，耗时12m
picrust2_pipeline.py -s ../otus.fa -i ../otutab.txt -o ./out -p 8
# 添加EC/KO/Pathway注释
cd out
add_descriptions.py -i pathways_out/path_abun_unstrat.tsv.gz -m METACYC \
  -o METACYC.tsv
add_descriptions.py -i EC_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat.tsv.gz -m EC \
  -o EC.tsv
add_descriptions.py -i KO_metagenome_out/pred_metagenome_unstrat.tsv.gz -m KO \
  -o KO.tsv
# KEGG按层级合并
db=/mnt/d/EasyMicrobiome/
python3 ${db}/script/summarizeAbundance.py \
  -i KO.tsv \
    -m ${db}/kegg/KO1-4.txt \
    -c 2,3,4 -s ',+,+,' -n raw \
    -o KEGG
# 统计各层级特征数量
wc -l KEGG*
# 可视化见picrust2文件夹中ggpicrust2.Rmd

元素循环FAPROTAX

## 方法1. 在线分析，推荐使用 http://www.bic.ac.cn/ImageGP/index.php/Home/Index/FAPROTAX.html 在线分析

## 方法2. Linux下分析、如QIIME 2环境下

# 设置工作目录
wd=/mnt/d/amplicon/result/faprotax/
mkdir -p ${wd} && cd ${wd}
# 设置脚本目录
sd=/mnt/d/EasyMicrobiome/script/FAPROTAX_1.2.7

### 1. 软件安装
# 注：软件已经下载至 EasyMicrobiome/script目录，在qiime2环境下运行可满足依赖关系
#(可选)下载软件新版本，以1.2.7版为例， 2023/7/14更新数据库
#wget -c https://pages.uoregon.edu/slouca/LoucaLab/archive/FAPROTAX/SECTION_Download/MODULE_Downloads/CLASS_Latest%20release/UNIT_FAPROTAX_1.2.7/FAPROTAX_1.2.7.zip
#解压
#unzip FAPROTAX_1.2.7.zip
#新建一个python3环境并配置依赖关系，或进入qiime2 python3环境
conda activate qiime2-2023.7
# source /home/silico_biotech/miniconda3/envs/qiime2/bin/activate
#测试是否可运行，弹出帮助即正常工作
python $sd/collapse_table.py

### 2. 制作输入OTU表
#txt转换为biom json格式
biom convert -i ../otutab_rare.txt -o otutab_rare.biom --table-type="OTU table" --to-json
#添加物种注释
biom add-metadata -i otutab_rare.biom --observation-metadata-fp ../taxonomy2.txt \
  -o otutab_rare_tax.biom --sc-separated taxonomy \
  --observation-header OTUID,taxonomy
#指定输入文件、物种注释、输出文件、注释列名、属性列名

### 3. FAPROTAX功能预测
#python运行collapse_table.py脚本、输入带有物种注释OTU表tax.biom、
#-g指定数据库位置，物种注释列名，输出过程信息，强制覆盖结果，结果文件和细节
#下载faprotax.txt，配合实验设计可进行统计分析
#faprotax_report.txt查看每个类别中具体来源哪些OTUs
python ${sd}/collapse_table.py -i otutab_rare_tax.biom \
  -g ${sd}/FAPROTAX.txt \
  --collapse_by_metadata 'taxonomy' -v --force \
  -o faprotax.txt -r faprotax_report.txt

### 4. 制作OTU对应功能注释有无矩阵
# 对ASV(OTU)注释行，及前一行标题进行筛选
grep 'ASV_' -B 1 faprotax_report.txt | grep -v -P '^--$' > faprotax_report.clean
# faprotax_report_sum.pl脚本将数据整理为表格，位于public/scrit中
perl ${sd}/../faprotax_report_sum.pl -i faprotax_report.clean -o faprotax_report
# 查看功能有无矩阵，-S不换行
less -S faprotax_report.mat

Bugbase细菌表型预测

### 1. Bugbase命令行分析
cd ${wd}/result
bugbase=${db}/script/BugBase
rm -rf bugbase/
# 脚本已经优化适合R4.0，biom包更新为biomformat
Rscript ${bugbase}/bin/run.bugbase.r -L ${bugbase} \
  -i gg/otutab.txt -m metadata.txt -c Group -o bugbase/

### 2. 其它可用分析
# 使用 http://www.bic.ac.cn/ImageGP/index.php/Home/Index/BugBase.html
# 官网，https://bugbase.cs.umn.edu/ ，有报错，不推荐
# Bugbase细菌表型预测Linux，详见附录3. Bugbase细菌表型预测

MachineLearning机器学习

# RandomForest包使用的R代码见advanced/RandomForestClassification和RandomForestRegression
## Silme2随机森林/Adaboost使用代码见EasyMicrobiome/script/slime2目录中的slime2.py，详见附录4
# 使用实战(使用QIIME 2的Python3环境，以在Windows中为例)
conda activate qiime2-2023.7
cd /mnt/d/EasyMicrobiome/script/slime2
#使用adaboost计算10000次(16.7s)，推荐千万次
./slime2.py otutab.txt design.txt --normalize --tag ab_e4 ab -n 10000
#使用RandomForest计算10000次(14.5s)，推荐百万次，支持多线程
./slime2.py otutab.txt design.txt --normalize --tag rf_e4 rf -n 10000

Evolution进化树

cd ${wd}
mkdir -p result/tree
cd ${wd}/result/tree

## 1. 筛选高丰度/指定的特征

#方法1. 按丰度筛选特征，一般选0.001或0.005，且OTU数量在30-150个范围内
#统计特征表中ASV数量，如总计1609个
tail -n+2 ../otutab_rare.txt | wc -l
#按相对丰度0.2%筛选高丰度OTU
usearch -otutab_trim ../otutab_rare.txt \
    -min_otu_freq 0.002 \
    -output otutab.txt
#统计筛选OTU表特征数量，总计~81个
tail -n+2 otutab.txt | wc -l

#方法2. 按数量筛选
# #按丰度排序，默认由大到小
# usearch -otutab_sortotus ../otutab_rare.txt  \
#     -output otutab_sort.txt
# #提取高丰度中指定Top数量的OTU ID，如Top100,
# sed '1 s/#OTU ID/OTUID/' otutab_sort.txt \
#     | head -n101 > otutab.txt

#修改特征ID列名
sed -i '1 s/#OTU ID/OTUID/' otutab.txt
#提取ID用于提取序列
cut -f 1 otutab.txt > otutab_high.id

# 筛选高丰度菌/指定差异菌对应OTU序列
usearch -fastx_getseqs ../otus.fa -labels otutab_high.id \
    -fastaout otus.fa
head -n 2 otus.fa

## 筛选OTU对物种注释
awk 'NR==FNR{a[$1]=$0} NR>FNR{print a[$1]}' ../taxonomy.txt \
    otutab_high.id > otutab_high.tax

#获得OTU对应组均值，用于样本热图
#依赖之前otu_mean.R计算过按Group分组的均值
awk 'NR==FNR{a[$1]=$0} NR>FNR{print a[$1]}' ../otutab_mean.txt otutab_high.id \
    | sed 's/#OTU ID/OTUID/' > otutab_high.mean
head -n3 otutab_high.mean

#合并物种注释和丰度为注释文件
cut -f 2- otutab_high.mean > temp
paste otutab_high.tax temp > annotation.txt
head -n 3 annotation.txt

## 2. 构建进化树

# 起始文件为 result/tree目录中 otus.fa(序列)、annotation.txt(物种和相对丰度)文件
# Muscle软件进行序列对齐，3s
muscle -in otus.fa -out otus_aligned.fas

### 方法1. 利用IQ-TREE快速构建ML进化树，2m
rm -rf iqtree
mkdir -p iqtree
iqtree -s otus_aligned.fas \
    -bb 1000 -redo -alrt 1000 -nt AUTO \
    -pre iqtree/otus

### 方法2. FastTree快速建树(Linux)
# 注意FastTree软件输入文件为fasta格式的文件，而不是通常用的Phylip格式。输出文件是Newick格式。
# 该方法适合于大数据，例如几百个OTUs的系统发育树！
# Ubuntu上安装fasttree可以使用`apt install fasttree`
# fasttree -gtr -nt otus_aligned.fas > otus.nwk

## 3. 进化树美化

# 访问http://itol.embl.de/，上传otus.nwk，再拖拽下方生成的注释方案于树上即美化

## 方案1. 外圈颜色、形状分类和丰度方案
# annotation.txt OTU对应物种注释和丰度，
# -a 找不到输入列将终止运行（默认不执行）-c 将整数列转换为factor或具有小数点的数字，-t 偏离提示标签时转换ID列，-w 颜色带，区域宽度等， -D输出目录，-i OTU列名，-l OTU显示名称如种/属/科名，
# cd ${wd}/result/tree
Rscript ${db}/script/table2itol.R -a -c double -D plan1 -i OTUID -l Genus -t %s -w 0.5 annotation.txt
# 生成注释文件中每列为单独一个文件

## 方案2. 生成丰度柱形图注释文件
Rscript ${db}/script/table2itol.R -a -d -c none -D plan2 -b Phylum -i OTUID -l Genus -t %s -w 0.5 annotation.txt

## 方案3. 生成热图注释文件
Rscript ${db}/script/table2itol.R -c keep -D plan3 -i OTUID -t %s otutab.txt

## 方案4. 将整数转化成因子生成注释文件
Rscript ${db}/script/table2itol.R -a -c factor -D plan4 -i OTUID -l Genus -t %s -w 0 annotation.txt

# 树iqtree/otus.contree在 http://itol.embl.de/ 上展示，拖拽不同Plan中的文件添加树注释

# 返回工作目录
cd ${wd}

## 4. 进化树可视化

https://www.bic.ac.cn/BIC/#/ 提供了更简易的可视化方式

# 附加视频

# 目录 Supp，网课有对应视频(可能编号不同，找关键字)


## S1. 网络分析R/CytoGephi

# 目录 Supp/S1NetWork

## S2. 溯源和马尔可夫链

# 目录 Supp/S2SourcetrackerFeastMarkov


## S11、网络分析ggClusterNet

# 代码：advanced/ggClusterNet/Practice.Rmd

## S12、Microeco包数据可视化

# 代码：advanced/microeco/Practice.Rmd

附录：Linux服务器下分析(选学)

#注：Windows下可能无法运行以下代码，推荐在Linux，或Windows下Linux子系统下conda安装相关程序

## 1. LEfSe分析

mkdir -p ~/amplicon/lefse
cd ~/amplicon/lefse
# format2lefse.Rmd代码制作或上传输入文件LEfSe.txt
# 安装lefse
# conda install lefse

#格式转换为lefse内部格式
lefse-format_input.py LEfSe.txt input.in -c 1 -o 1000000
#运行lefse
run_lefse.py input.in input.res
#绘制物种树注释差异
lefse-plot_cladogram.py input.res cladogram.pdf --format pdf
#绘制所有差异features柱状图
lefse-plot_res.py input.res res.pdf --format pdf
#绘制单个features柱状图(同STAMP中barplot)
head input.res #查看差异features列表
lefse-plot_features.py -f one --feature_name "Bacteria.Firmicutes.Bacilli.Bacillales.Planococcaceae.Paenisporosarcina" \
   --format pdf input.in input.res Bacilli.pdf
#批量绘制所有差异features柱状图，慎用(几百张差异结果柱状图阅读也很困难)
mkdir -p features
lefse-plot_features.py -f diff --archive none --format pdf \
  input.in input.res features/


## 2. PICRUSt功能预测

#推荐使用 http://www.bic.ac.cn/BIC/#/analysis?tool_type=tool&page=b%27Mzk%3D%27 在线分析
#有Linux服务器用户可参考以下代码搭建本地流程

n=picrust
conda create -n ${n} ${n} -c bioconda -y

wd=/mnt/d/amplicon
cd $wd/result/gg
# 启动环境
conda activate picrust
#上传gg/otutab.txt至当前目录
#转换为OTU表通用格式，方便下游分析和统计
biom convert -i otutab.txt \
    -o otutab.biom \
    --table-type="OTU table" --to-json

# 设置数据库目录，如 /mnt/d/db
db=~/db
#校正拷贝数，30s, 102M
normalize_by_copy_number.py -i otutab.biom \
    -o otutab_norm.biom \
    -c ${db}/picrust/16S_13_5_precalculated.tab.gz
#预测宏基因组KO表，3m,1.5G，biom方便下游归类，txt方便查看分析
predict_metagenomes.py -i otutab_norm.biom \
    -o ko.biom \
    -c ${db}/picrust/ko_13_5_precalculated.tab.gz
predict_metagenomes.py -f -i otutab_norm.biom \
    -o ko.txt \
    -c ${db}/picrust/ko_13_5_precalculated.tab.gz

#按功能级别分类汇总, -c输出KEGG_Pathways，分1-3级
sed  -i '/# Constru/d;s/#OTU //' ko.txt
num=`head -n1 ko.txt|wc -w`
paste <(cut -f $num ko.txt) <(cut -f 1-$[num-1] ko.txt) > ko.spf
for i in 1 2 3;do
  categorize_by_function.py -f -i ko.biom -c KEGG_Pathways -l ${i} -o pathway${i}.txt
  sed  -i '/# Const/d;s/#OTU //' pathway${i}.txt
  paste <(cut -f $num pathway${i}.txt) <(cut -f 1-$[num-1] pathway${i}.txt) > pathway${i}.spf
done
wc -l *.spf


## 3. Bugbase细菌表型预测

### 1. 软件安装(己整合到EasyMicrobiome中，原代码需要更新才能在当前运行)
#有两种方法可选，推荐第一种，可选第二种，仅需运行一次
# #方法1. git下载，需要有git
# git clone https://github.com/knights-lab/BugBase
# #方法2. 下载并解压
# wget -c https://github.com/knights-lab/BugBase/archive/master.zip
# mv master.zip BugBase.zip
# unzip BugBase.zip
# mv BugBase-master/ BugBase

cd BugBase
#安装依赖包
export BUGBASE_PATH=`pwd`
export PATH=$PATH:`pwd`/bin
#安装了所有依赖包
run.bugbase.r -h
#测试数据
run.bugbase.r -i doc/data/HMP_s15.txt -m doc/data/HMP_map.txt -c HMPBODYSUBSITE -o output


### 2. 准备输入文件
cd ~/amplicon/result
#输入文件：基于greengene OTU表的biom格式(本地分析支持txt格式无需转换)和mapping file(metadata.txt首行添加#)
#上传实验设计+刚才生成的otutab_gg.txt
#生成在线分析使用的biom1.0格式
biom convert -i gg/otutab.txt -o otutab_gg.biom --table-type="OTU table" --to-json
sed '1 s/^/#/' metadata.txt > MappingFile.txt
#下载otutab_gg.biom 和 MappingFile.txt用于在线分析

### 3. 本地分析
export BUGBASE_PATH=`pwd`
export PATH=$PATH:`pwd`/bin
run.bugbase.r -i otutab_gg.txt -m MappingFile.txt -c Group -o phenotype/

## 4. Silme2随机森林/Adaboost

#下载安装
# cd ~/software/
# wget https://github.com/swo/slime2/archive/master.zip
# mv master.zip slime2.zip
# unzip slime2.zip
# mv slime2-master/ slime2
# cp slime2/slime2.py ~/bin/
# chmod +x ~/bin/slime2.py
#安装依赖包
# sudo pip3 install --upgrade pip
# sudo pip3 install pandas
# sudo pip3 install sklearn


## 5. PICRUSt2环境导出和导入

# 方法1. 下载安装包并解压 
# 下载安装包，备用链接见百度云：https://pan.baidu.com/s/1Ikd_47HHODOqC3Rcx6eJ6Q?pwd=0315
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/conda/picrust2.tar.gz
# 指定安装目录并解压
mkdir -p ~/miniconda3/envs/picrust2
tar -xvzf picrust2.tar.gz -C ~/miniconda3/envs/picrust2
# 激活环境并初始化
conda activate picrust2
conda unpack

# 方法2. 直接安装或打包安装环境
n=picrust2
conda create -n ${n} -c bioconda -c conda-forge ${n}=2.3.0_b
# 加载环境
conda activate ${n}
# 打包环境(可选)
conda pack -n ${n} -o ${n}.tar.gz


# 常见问题

## 1. 文件phred质量错误——Fastq质量值64转33

# 使用head查看fastq文件，phred64质量值多为小写字母，需要使用vsearch的--fastq_convert命令转换为通用的phred33格式。

cd /c/amplicon/FAQ/01Q64Q33
# 预览phred64格式，注意看第4行质量值多为小写字母
head -n4 test_64.fq
# 转换质量值64编码格式为33
vsearch --fastq_convert test_64.fq \
    --fastq_ascii 64 --fastq_asciiout 33 \
    --fastqout test.fq 
# 查看转换后33编码格式，质量值多为大写字母
head -n4 test.fq

# 如果是Ion torrent测序结果，由于是非主流测序平台，需要公司转换帮助转换为标准的Phred33格式文件才可以使用。

## 2. 序列双端已经合并——单端序列添加样本名

# 扩增子分析要求序列名为样品名+序列编号，双端序列在合并同时可直接添加样本名。单端序列，或双端合并的序列需单独添加。这里使用vsearch的--fastq_convert命令中的--relabel参加添加样本名

cd /c/amplicon/FAQ/02relabel
# 查看文件序列名
head -n1 test.fq
# 序列按样本重命名
vsearch --fastq_convert test.fq \
    --relabel WT1. \
    --fastqout WT1.fq
# 查看重命名结果
head -n1 WT1.fq

## 3. 数据过大无法使用usearch聚类或去噪,替换vsearch

# 仅限usearch免费版受限时，可通过提高minuniquesize参数减少非冗余数据量。OTU/ASV过万下游分析等待时间过长，确保OTU/ASV数据小于5000，一般不会受限，而且也有利于下游开展快速分析。

# 备选vsearch聚类生成OTU，但无自动de novo去嵌合功能。输入2155条序列，聚类后输出661。

cd /c/amplicon/FAQ/03feature
# 重命名relabel、按相似id=97%聚类，不屏蔽qmask
# 记录输入sizein和输出频率sizeout
vsearch --cluster_size uniques.fa  \
 --relabel OTU_ --id 0.97 \
 --qmask none --sizein --sizeout \
 --centroids otus_raw.fa 


# 再de novo去嵌合。55个嵌合，606个非嵌合。把OTU_1都去除了，没有Usearch内置去嵌合的方法合理。

# 自身比对去嵌合
vsearch --uchime_denovo otus_raw.fa \
    --nonchimeras otus.fa
# 删除序列频率
sed -i 's/;.*//' otus.fa

## 4. 读长计数(Read counts)标准化为相对丰度

cd /c/amplicon/FAQ/04norm
# 求取各个OTU在样品中的丰度频率(标准化为总和1)
usearch -otutab_counts2freqs otutab.txt \
    -output otutab_freq.txt

## 5. 运行R提示Permission denied

# 例如write.table保存表时，报错信息示例如下：意思是写入文件无权限，一般为目标文件正在被打开，请关闭相关文件后重试

Error in file(file, ifelse(append, "a", "w")) :
Calls: write.table -> file
: Warning message:
In file(file, ifelse(append, "a", "w")) :
  'result/raw/otutab_nonBac.txt': Permission denied

## 6. 文件批量命名

# 如我们有文件A1和A2，编写一个样本名对应目标名的表格metadata.txt，检查样本名是否唯一，使用awk进行批量改名

cd /c/amplicon/FAQ/06rename
# (可选)快速生成文件列表，用于编辑metadata.txt，如A1.fq修改为WT1.fastq，以此类推，参考metadata.bak.txt
ls *.fq > metadata.txt
# 编辑列表，第二名为最终命名，确定名称唯一
# 转换行尾换行符
sed -i 's/\r//' metadata.txt
# 检查手动命名列2是否唯一
cut -f 2 metadata.txt|wc -l
cut -f 2 metadata.txt|sort|uniq|wc -l
# 如果两次结果一致，则命名非冗余
# 可选移动mv，复制cp，硬链ln，或软链ln -s
# 此处使用复制cp
awk '{system("cp "$1" "$2)}' metadata.txt

## 7. Rstudio中Terminal找不到Linux命令

# 需要把 C:\Program Files\Git\usr\bin 目录添加到系统环境变量
# 文件资源管理器——此电脑——属性——高级系统设置——环境变量——系统变量——Path——编辑——新建——填写“C:\Program Files\Git\usr\bin”——确定——确定——确定
# 注意win10系统是一个目录一行；win7中多个目录用分号分隔，注意向后添加目录

## 8. usearch -alpha_div_rare结果前两行出现“-”

#问题：抽样0时补“-”，且缺失制表符

#处理：替换“-”为"制作符\t+0"即可恢复

cd /c/amplicon/FAQ/08rare
sed "s/-/\t0.0/g" alpha_rare_wrong.txt\
    > alpha_rare.txt

## 9. 物种注释otus.sintax方向全为“-”，需要序列取反向互补

#是原始序列方向错误，将filtered.fa序列需要取反向互补。再从头开始分析

cd /c/amplicon/FAQ/09revcom
vsearch --fastx_revcomp filtered_RC.fa \
  --fastaout filtered.fa

## 10. windows换行符查看和删除

#Windows换行符为换行($)+^M，等于Linux换行+mac换行。分析数据中以linux格式为通用标准，因此windows中如excel编写并存为文本文件(制表符分隔)(*.txt)的表格，行尾有不可见的^M符号，导致分析出错。可使用cat -A命令查看此符号，可用sed删除。

cd /c/amplicon/FAQ/10^M
# 查看行尾是否有^M
cat -A metadata.txt
# 删除^M，并写入新文件
sed 's/\r//' metadata.txt > metadata.mod.txt
# 检查是否成功
cat -A metadata.mod.txt

# 直接原文件删除
sed -i 's/\r//' metadata.txt

## 11. UNITE数据库分析报错

#USEARCH使用UNITE下载的utax数据库，提示各种错误

cd /c/amplicon/FAQ/11unite
# 解压Unite的useach使用物种注释库
gunzip -c utax_reference_dataset_all_04.02.2020.fasta.gz > unite.fa
# 对ITS序列进行注释，默认阈值0.8
usearch --sintax  otus.fa \
  --db unite.fa \
  --tabbedout otus.sintax --strand plus
   --sintax_cutoff 0.6

#报错信息如下：
---Fatal error---
Missing x: in name >JN874928|SH1144646.08FU;tax=d:Metazoa,p:Cnidaria,c:Hydrozoa,o:Trachylina,f:,g:Craspedacusta,s:Craspedacusta_sowerbii_SH1144646.08FU;
“Unprintable ASCII character no 195 on or right before line 236492”

# 分析原因为分类级存在空缺。可用sed补全即可解决
# 分类级存在空缺，sed补全
sed -i 's/,;/,Unnamed;/;s/:,/:Unnamed,/g' unite.fa
# 再运行前面usearch --sintax命令
#注：vsearch有问题，推荐用usearch，结尾添加--strand plus才能成功运行

## 12. Windows的Linux子系统本地安装qiime2

# 详见 qiime2/pipeline_qiime2.sh
n=qiime2-2023.2
# 安装包下载链接 
wget -c ftp://download.nmdc.cn/tools/conda/${n}.tar.gz
# 新环境安装
mkdir -p ~/miniconda3/envs/${n}
tar -xzf ${n}.tar.gz -C ~/miniconda3/envs/${n}
# 激活并初始化环境
conda activate ${n}
conda unpack

## 13. RDP 16-18注释结果比较

# 统计序列中门的数量，从60降为39
grep '>' ${db}/usearch/rdp_16s_v16_sp.fa|cut -f2 -d ';'|cut -f1-2 -d ','|sort|uniq|wc -l
grep '>' ${db}/usearch/rdp_16s_v18.fa|cut -f2 -d ';'|cut -f1-2 -d ','|sort|uniq|wc -l
# 统计序列中属的数量，从2517增长为3061
grep '>' ${db}/usearch/rdp_16s_v16_sp.fa|cut -f2 -d ';'|cut -f1-6 -d ','|sort|uniq|wc -l
grep '>' ${db}/usearch/rdp_16s_v18.fa|cut -f2 -d ';'|cut -f1-6 -d ','|sort|uniq|wc -l

cd /c/amplicon/FAQ/13rdp16_18
# 门由15个降为13个
tail -n+2 rdp16_sintax.txt|cut -f3|sort|uniq -c|wc -l
tail -n+2 rdp18_sintax.txt|cut -f3|sort|uniq -c|wc -l
# 属由176个降为144个
tail -n+2 rdp16_sintax.txt|cut -f7|sort|uniq -c|wc -l
tail -n+2 rdp18_sintax.txt|cut -f7|sort|uniq -c|wc -l  


## 14. usearch生成OTU表小样本比vsearch更快

# usearch生成特征表，小样本(<30)快；但大样本受限且多线程效率低，83.2%, 4核17s
time usearch -otutab temp/filtered.fa \
  -otus result/raw/otus.fa \
  -threads 4 \
  -otutabout result/raw/otutab.txt

# vsearch比对，更准更慢，但并行24-96线程更强
vsearch --usearch_global temp/filtered.fa --db ${db}/gg/97_otus.fa \
  --otutabout result/gg/otutab.txt --id 0.97 --threads 12
# 比对率81.04%, 1核30m, 12核7m