2022-05-25

Nat Rev | 基于质谱的蛋白质组学在药物发现中的新作用

原创 huacishu 图灵基因 2022-05-25 13:46 发表于江苏

收录于合集#前沿分子生物学技术

撰文：huacishu

IF=84.694

推荐度：⭐⭐⭐⭐⭐

亮点：

1、作者描述了蛋白质组学和化学蛋白质组学方法，用于靶点识别和验证，以及可能存在的问题；

2、作者讨论了早期药物发现的创新策略，其中对蛋白质组学方法产生了独特的见解，例如靶向蛋白质降解和反应性片段的使用，并为实验策略的成功提供指导。

德国马克斯·普朗克生物化学研究所Felix Meissner博士课题组在国际知名期刊Nat Rev Drug Discov在线发表题为“The emerging role of mass spectrometry-based proteomics in drug discovery”的论文。蛋白质是大多数药物的主要靶点；然而，用于监测蛋白质活性和功能的系统方法在药物发现中仍然没有得到充分利用。新的生物化学方法，再加上基于质谱的蛋白质组学仪器和数据分析的最新发展，现在已经能够以前所未有的分辨率和维度剖析疾病表型及其如何由生物活性分子调控的。在这篇综述中，作者描述了蛋白质组学和化学蛋白质组学方法，用于靶点识别和验证，以及用于识别安全隐患。讨论了早期药物发现的创新策略，其中对蛋白质组学方法产生了独特的见解，例如靶向蛋白质降解和反应性片段的使用，并为成功的关键实验策略提供指导。

药物发现可以被认为是一个三要素方程式，其中生物活性化合物被开发出来作用于分子靶点并调节疾病表型。因此，药物发现工作是从不同的实验起点开始的，例如通过生物活性化合物探测的可能靶点或疾病模型（图1）。基于靶点的策略可以通过大文库的高通量筛选（HTS）或基于片段的方法识别与重组靶蛋白结合的小分子。一旦识别出相应分子，化合物在细胞或体内模型系统中的亲和力、物理和化学性质、吸收和分布以及靶点参与、功效和安全性都将得到优化。这些基于靶点的方法已经变得非常有吸引力，因为人们越来越了解疾病病理学的分子机制，以及HTS技术的巨大进步，如DNA编码的文库筛选，以及分析化合物-靶点相互作用的生物物理方法（图1a，b）。然而，从历史上看，大多数一流药物都是在监测疾病模型系统中生物活性化合物的生物反应上发现的。生物活性化合物的后续靶点识别有助于了解靶点相关的安全风险，确定命中序列的优先级，并提供基于结构的方法（图1b，c）。类似地，基因编辑技术的革命使全基因组基因编辑（如CRISPR–Cas9敲除、CRISPR干扰（CRISPR）或CRISPR激活（CRISPRa））得以使用，这些方法可以识别尚未建立化学可处理性的前所未有的靶点。然而，正如II期和III期临床试验中由于靶点验证不足、缺乏有效性以及与靶点效应和非靶点效应相关的安全性问题所表明的，简化方法不一定能转化为安全有效的药物。

基于质谱（MS）的蛋白质组学已经从对生物样本中的蛋白质进行分类发展到在多个层面上评估蛋白质特性及其功能调节。通过各个方面（速度、灵敏度、精度）的最新进展，基于MS的蛋白质组学已经达到了一个水平，可以在几小时内对几乎完整的蛋白质组进行分析（图2）。在这些技术发展的推动下，已经设计出实验策略来描述蛋白质组，而不仅仅是列出相关基因；现代蛋白质组学方法研究生物活性分子的参与和反应性，解析蛋白质信号网络中的时空动力学，并在蛋白质组范围内产生翻译后修饰（PTM）的全面功能注释。在这里，作者描述了蛋白质组学如何通过提供与药物治疗、遗传扰动和疾病表型相关的蛋白质活性和功能的定量测量来促进临床前药物发现（图1）。作者提出了实验策略，以确定药物的靶向疗效、导致不良表型的潜在非靶向性以及靶向可操作性和选择性。还描述了相关方法，用于剖析蛋白质丰度、转换、亚细胞定位、相互作用和修饰，用于目标发现和验证。最后，讨论了基础研究的创新对早期药物发现的影响，包括靶向不可逆抑制剂和蛋白质降解、基于片段的配体发现，以及其他技术挑战。

一系列方法可用于确定生物活性化合物在细胞筛选和体内激发其活性的分子机制。其中，基于质谱的蛋白质组学有助于直接分析小分子与蛋白质组的相互作用。具体而言，化学蛋白质组学使生化或生物物理程序能够检测化合物与蛋白质的直接相互作用（图1a）。化学蛋白质组学方法通常依赖于从研究中的生物活性化合物衍生的化学探针从细胞提取物或活细胞系统中富集药物靶点。此外，一些新兴的方法利用了化合物结合对蛋白质结构和生物物理性质的影响，如热稳定性或对蛋白质水解的抵抗力（图3）。生物活性化合物的目标识别通常基于亲和富集，其中生物活性分子通过亲和标签（例如生物素）或（生物正交）反应基团衍生，以实现固定化。亲和富集能够在与细胞蛋白质孵育时分离与功能探针相互作用的蛋白质。药物亲和力富集策略的早期应用将组蛋白脱乙酰酶（HDAC）确定为微生物衍生环四肽曲霉素的哺乳动物靶点，将FKBP12确定为免疫抑制剂大环内酯类药物FK506和雷帕霉素的受体，并确定了roscovitine（一种环素依赖性激酶的选择性抑制剂）的靶点。利用标记的生物活性小分子进行亲和富集和基于定量质谱的蛋白质组学相结合，为全面分析细胞蛋白质组内的药物相互作用提供了一种灵敏和特异的工具。这种技术通常被称为化合物中心化学蛋白质组学（CCCP）（图3b）。为了使CCCP能够识别功效靶点，需要关于化合物的结构-活性关系（SAR）的详细信息，以保留用于蛋白质靶点亲和捕获的类似物的生物活性，并通过MS进行后续识别，小分子探针和目标蛋白质之间的相互作用可以通过光亲和标记（PAL）通过二嗪类和芳香族叠氮化合物等光活性基团转化为共价键（图3b）。当化合物特异性探针不可用或与目标亲和力太低而无法进行富集活动时，基于活性的探针分析（ABPP）提供了一种合适的替代方法。这种方法通过捕获具有保守结合位点或通过一个或多个药效团的共同反应性的内源性产生的蛋白质，来检测化合物与蛋白质组（亚蛋白质组）亚群的结合（图3c）。与CCCP一样，剂量依赖性竞争分析与定量MS相结合，可以在单个实验中测定小分子化合物对所有特异性捕获蛋白质的IC50值和表观解离常数。最近，出现了几种不用探针检测小分子蛋白质结合的蛋白质组学方法。通过测量热稳定性、抗蛋白水解能力或氨基酸侧链表面暴露的变化，利用配体诱导效应对目标蛋白质的生物物理性质产生影响。将这些方法与定量MS相结合，可以实现蛋白质组范围内的测量。例如，热蛋白质组分析（TPP）也称为细胞热位移分析（CETSA）—MS可以通过分析药物诱导的蛋白质热稳定性在蛋白质组中的变化来解读药物的MoA（图3d）。最近描述的2D热蛋白质组分析（2D-TPP）通过将温度依赖性和等温配体浓度依赖性实验整合到一个分析方案中，解决了这两个挑战（图3d）。与蛋白质结合的小分子通过稳定折叠状态影响热稳定性和蛋白质对蛋白水解裂解的敏感性（图3d）。药物亲和力响应靶稳定性（DARTS）测量直接结合药物后靶蛋白蛋白酶敏感性的降低（图3e）。类似地，有限蛋白水解耦合质谱（LIP–MS）产生蛋白水解肽，在化合物存在时作为蛋白质折叠的报告物（图3e）。总之，基于探针的化学蛋白质组学可以实现低丰度靶标或靶标类别的特异性富集，而这些靶标或靶标类别在整体分析中可能会被遗漏或未被观察到。因此，对于CCCP方法，通常需要多个化学探针来全面表征细胞内和细胞外靶点。相反，基于生物物理或生物化学原理的直接靶点分析，可以在广泛的亲和力范围内检测小分子-靶点相互作用，不需要耗时的探针设计，并且由于蛋白质组覆盖范围的敏感性和深度增加以及周转速度加快，正逐渐变得更具吸引力。然而，CETSA、TPP以及LIP-MS和相关方法仍然受到假阴性和蛋白质组覆盖不完整的限制，难以适应体内系统。

组学技术现在通常用于对不同的生物分子类别和正交功能筛选方法（例如，使用CRISPR–Cas9基因编辑）进行综合评估，以描绘细胞或生物体中的复合效应。与基于MS的蛋白质组学相结合的多方面细胞生物学和生物化学方法的最新发展也使得测量蛋白质的多种功能特性成为可能（图1a，4）。这些方法有助于区分药物是通过调节蛋白质的表达、转换、定位、修饰或与其他蛋白质的相互作用，还是通过这些因素的组合，直接或间接发挥作用。由于大多数FDA批准的药物针对细胞外信号蛋白，分析细胞表面受体连接（例如通过受体酪氨酸激酶（RTK）和G蛋白偶联受体（GPCR））触发的信号通路的蛋白质组学方法很早就引起了人们的兴趣（图4a）。随着时间的推移，蛋白质组的变化可以反映预期的复合效应，但也可以反映不利或副作用或代偿机制，以恢复可能导致耐药性的内稳态。此外，分析治疗耐药细胞可能揭示这种耐药的潜在机制。通过药物和细胞系的分析，提出了一种将化合物作用与整体蛋白质组扰动联系起来的策略。表达蛋白质组学也很容易检测到细胞表面受体连接和内化引起的蛋白质降解。为了确定药物治疗是否影响整体蛋白质周转，所有新合成的蛋白质都可以在动态脉冲追踪实验中进行代谢标记，使用细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记（SILAC120），这使得它们与细胞中已经存在的蛋白质区分开来（图4b）。蛋白质组学在提供蛋白质丰度以外的信息方面同样强大，例如蛋白质在细胞或组织中的定位。专门的方法使人们能够根据亚细胞成分的选择性富集或耗竭，对亚细胞结构进行集中观察。当假定药物的MoA指导此类研究时，这些方法可以对细胞器（如细胞核或线粒体）以及细胞表面或细胞外空间的蛋白质进行全面分析。为了绘制跨多个亚细胞结构的蛋白质空间动力学图，蛋白质组学分析和基于邻近连接的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络同样已成为强有力的工具（图4d）。阐明PPI的经典方法是通过免疫沉淀或亲和纯化单个内源性或表位标记的蛋白质来捕获直接和间接的蛋白质相互作用物（图4d）。大多数细胞内信号转导途径是通过翻译后修饰（PTMs）对蛋白质进行动态修饰来调节的。用于全面检测稳定PTM修饰肽的蛋白质组学方法已经建立，并可用于监测药物诱导的信号变化（图4c）。因为大多数动态PTM都是亚化学计量的（它们只发生在蛋白质的子集上），所以这些工作流程通常包括使用具有适当物理性质的基质或抗体的富集步骤。因此，它们可能需要比表达蛋白质组学实验多得多的生物材料。共价药物被批准用于各种适应症，并针对多个蛋白质家族，包括激酶、蛋白酶和泛素酶。然而，由于杂乱的标签和特殊的药物反应引起的安全问题，过去以靶向为基础的活性化合物药物发现是谨慎的。最近，“靶向共价抑制剂”再次出现，尤其是在肿瘤学的药物发现中，这种抑制剂首先与靶蛋白结合，然后迅速与靶位点的特定残基形成共价键。由于可以同时监测这些药物的可逆结合和共价键形成，因此，尽管结合亲和力适中，但通过化学蛋白质组学可以优化非平衡动力学，使其完全占据靶区。在这样的实验中，相应的肽片段光谱提供了主要蛋白质靶标的共价修饰氨基酸残基的直接证据（图2d、4e）。因此，利用可逆配体设计靶向共价抑制剂可以得到探索共价配体可配性的基本蛋白质组学研究工具的支持。

尽管本综述描述了许多进展和成功，但由于成本和所需的专业知识，蛋白质组学分析对药物发现的影响仍然受到MS技术的限制。作者认为，随着基于MS的蛋白质组学越来越被认为是阐明疾病失调机制和监测药物作用的强大和多功能工具，这种情况正在发生变化。可用的仪器、软件和工作流程已经基本成熟，并且功能更加强大。尽管与其他组学技术（如RNA测序方法）相比，蛋白质组学仍然缺乏敏感性和覆盖面，但它提供了与疾病和药物作用机制信息直接相关的独特功能维度。预期基于MS的技术的进一步发展将进一步提高灵敏度，并将使研究仅限于少数或单个细胞、细胞异质性、药物作用的亚细胞空间机制和分子疾病表型成为可能。这些发展得到了新兴计算概念和软件解决方案的支持，并将使尚未识别的PTM、反应性探针或药物变得容易获得。化学蛋白质组学和具有时空分辨率的深层蛋白质组分析技术的最新进展通过促进靶点验证和模型表征支持早期药物发现。活检样本中的单个细胞类型或状态可以使用“深度视觉蛋白质组学”进行深入分析，这是一种人工智能驱动的细胞分割和分类，然后是超高灵敏度蛋白质组学的组合。当在药物治疗前后进行时，这种精确肿瘤学的新方法可以在空间环境中直接可视化肿瘤适应和逃逸。这些进展可以建立从体外到体内系统的可翻译性，为模式选择提供信息，并支持药物MoA研究和安全性研究。对于靶点识别，基于蛋白质组学的策略很有希望，但还没有提供“一站式”方法，因为每种可用的方法都有其优点和局限性。将这些方法系统地融入到药物发现项目中，将极大地缩短候选药物发现周期。

教授介绍

Felix Meissner博士的研究小组在波恩大学医院的免疫研究所，同时也在马克斯·普朗克生物化学研究所工作。人体内的免疫反应高度协调，以便通过量身定制的防御反应抗击感染。Felix Meissner博士和他的研究小组“实验系统免疫学”希望通过详细阐明免疫系统的工作组之间的沟通，来解释它们是如何协同工作的。Felix Meissner博士和他的团队首次能够分析免疫细胞分泌的全部信使蛋白。除了确切数量的数百种具有通讯功能的蛋白质外，他们还发现了在细胞间传递信息的新免疫信号。在未来的研究中，他和他的团队将继续关注免疫系统的第一道防线。其他医学领域也将受益于这些发现：细胞通讯在身体的所有炎症反应中发挥作用—例如在败血症、风湿、动脉粥样硬化、神经退行性变、糖尿病和许多其他疾病中。

参考文献

Meissner F, Geddes-McAlister J, Mann M, Bantscheff M. The emerging role ofmass spectrometry-based proteomics in drug discovery. Nat Rev Drug Discov.2022;10.1038/s41573-022-00409-3. doi:10.1038/s41573-022-00409-3